DCC和MKK4基因在結直腸癌組織中的表達及臨床意義*

張 慧,陳景志,陳建立,張 琪,張國志

華北理工大學附屬醫院普外科(唐山 063000)

結直腸癌是臨床上常見的消化道腫瘤，據統計，結直腸癌的發病率和病死率分別居全球癌癥發病率和病死率的第3位和第2位，2018年全球新增結直腸癌患者約185萬例，死亡約88萬例[1]。結直腸癌的發病率與國家經濟發展水平呈正相關，欠發達國家結直腸癌的發病率僅為發達國家的1/3左右。相對于發病率來說，結直腸癌的病死率在全球各地區差異較小[2]。發達國家結直腸癌病死率下降主要原因是有效且規范的腫瘤治療管理策略以及針對結直腸癌開展大規模的篩查及早診早治項目[3]。目前結直腸癌的發病原因尚不明確，有研究表明，超重和肥胖[4]、久坐[4-5]、紅肉和加工肉制品的攝入[6]可增加患結直腸癌的風險，體育鍛煉[4-5]、谷類等植物性食物[7]、魚類[8]、維生素D[9-10]、鈣[11]、葉酸[12]的攝入會降低患結直腸癌的風險。由于結直腸癌早期缺乏典型的癥狀和體征，且缺乏高靈敏度和強特異性的早期診斷技術，大部分患者就診時已是中晚期，失去了最佳治療時機，因此臨床上應進行早期診斷，積極采取治療措施[13]。結直腸癌缺失基因(Delected in colorectal carcinoma ,DCC)被認為是最大的抑癌基因之一，參與結直腸癌的演變及轉移。絲裂原活化蛋白激酶激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，可同時磷酸化并激活JNK及P38信號轉導通路，導致細胞增殖、分化及凋亡等。本研究采用RT-PCR、Western-blot、免疫組織化學法，檢測60例結直腸癌組織及對應癌旁組織中DCC、MKK4的表達情況，并分析其表達與臨床病理因素的關系，為結直腸癌的診斷提供新的生物學標記和腫瘤基因治療的靶點。

資料與方法

1 一般資料 收集60例華北理工大學附屬醫院2017年9月至2018年8月手術切除的結直腸癌組織標本及其對應的癌旁組織標本，其中男38例，女22例；≤60歲患者36例，>60歲患者24例，腫瘤位于結腸者32例，位于直腸者28例；隆起型25例，潰瘍型30例，浸潤型5例；高分化者12例，中分化者40例，低分化者8例；伴有淋巴轉移19例，無淋巴轉移41例；伴有遠處轉移10例，無遠處轉移50例；浸潤深度：T14例、T214例、T336例、T46例。所有患者術前均未接受化學藥物治療及放射治療。所有手術標本于術后30 min內置于液氮中，-80℃冰箱儲存備用，癌旁組織取距離腫瘤邊緣5 cm以上的組織。

2 主要試劑 PCR試劑：DCC、MKK4引物(美國Invitrogen公司)，TRIpure Reagent(上?？道噬锕?，逆轉錄試劑盒(美國Gene Copoeia公司)，Beyo Fast SYBR Green Qpcr Mix試劑盒(廣州碧云天生物技術有限公司)。Western-blot試劑：anti-DCC，稀釋度1∶2000、anti-MKK4，稀釋度1∶1000、anti-GAPDH，稀釋度1∶1000(美國Affinity公司)。免疫組織化學試劑：DCC兔源的單克隆抗體，稀釋度1∶250、MKK4兔源的單克隆抗體，稀釋度1∶200(武漢博士德生物公司)，DAB染色試劑盒(武漢博士德生物公司)，PBS(上海士鋒生物公司)。

3 研究方法 ①RT-PCR：組織總RNA提取，檢測RNA濃度及純度(A260/A280=1.8～2.0最佳)，RNA逆轉錄為cDNA，PCR擴增(擴增條件95℃預變性5 min、95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s、40個循環。引物設計：DCC：Forward 5'-CGGAGCAGGAAGAAGTCAGT-3'，Reverse5'-GCTTTTCCAGCCAACCCAAG-3';MKK4：Forward 5'-TCGGCTCTTCACTCCCAACA-3'，Reverse 5'-TCAACTTCAGTGCTTTGCGTT -3';GAPDH：Forward 5' -ATGATGATATCGCCGCGCTC-3'，Reverse 5' -GTACATGGCTGGGGTGTTGA-3'。②Western-blot：提取組織蛋白，蛋白充分變性后測濃度，Western-blot檢測不同組織中DCC、MKK4的表達情況，內參選用GAPDH。③免疫組化：包埋、切片，脫蠟、染色、脫水、透明、封固(陰性對照以PBS代替第一抗體)。

4 結果判讀 ①RT-PCR:DCC、MKK4基因的相對表達量采用2-△△CT法進行定量分析。②Western-blot：應用軟件Image J分析條帶灰度值。DCC蛋白相對表達量=DCC灰度值/GAPDH灰度值,MKK4蛋白相對表達量=MKK4灰度值/GAPDH灰度值。③免疫組織化學：DCC、MKK4蛋白表達主要位于細胞漿，其中出現淡黃色至棕褐色顆粒且染色強度高于背景特異性著色者為陽性細胞。光鏡下綜合考慮染色強度和陽性染色細胞數百分率記分進行結果判斷[2]。按染色強度記分:0分為無色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。按陽性染色細胞百分率記分,1分為11%～50%,2分為51%～75%,3分為>75%,兩項得分相乘結果>3為陽性(+)病例,≤3為陰性(-)病例。

5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進計分析。獨立樣本比較采用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗或確切概率法，所有結果均以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 RT-PCR法檢測結直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4基因表達水平 結直腸癌組織中DCCmRNA、MKK4mRNA表達水平均低于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 DCCmRNA、MKK4mRNA在結直腸癌及對應癌旁組織中的表達水平

2 Western-blot法檢測結直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達水平 結直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達均明顯低于癌旁組織(圖1)，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

圖1 結直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4蛋白的表達情況

表2 DCC、MKK4蛋白在結直腸癌及癌旁組織中的表達水平(灰度值)

3 免疫組織化學法檢測結直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4蛋白表達 DCC、MKK4蛋白表達主要定位于細胞漿中，少數見于細胞核(圖2)。結直腸癌組織中DCC蛋白表達陽性率為20.0%,對應癌旁組織中DCC蛋白表達陽性率96.7%,差異具有統計學意義(P<0.05);結直腸癌組織中MKK4蛋白表達陽性率為28.3%,對應癌旁組織中MKK4蛋白表達陽性率95.0%,差異具有統計學意義(P<0.05);見表3。

表3 直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4蛋白表達比較[例(%)]

圖2 DCC、MKK4蛋白在結直腸癌及癌旁組織的表達(Elivison法，×200)

4 結直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達與臨床病理參數的關系 DCC、MKK4蛋白表達水平均與腫瘤分化程度、淋巴轉移、遠處轉移有顯著相關性(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位、大體形態、浸潤深度等無統計學相關性(P>0.05)，見表4。

表4 結直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達與臨床病理參數關系

討 論

1 DCC與結直腸癌的關系 結直腸癌缺失基因(DCC),是一個重要的抑癌基因，于1990年被Fearon等[14]確認并命名，定位于人染色體18q21.3,是細胞生長、分化及生存的重要調節者，其表達產物p192是一種細胞黏附因子，在細胞信號傳導中發揮重要作用，可使細胞間具有較強的黏著性，限制細胞的轉移能力，因此DCC基因的缺失會減弱細胞之間的相互作用，造成細胞的惡性轉移。研究發現DCC基因在胃癌[15]、卵巢癌[16]、子宮頸癌[17]、子宮內膜癌[18]中表達下調。本實驗結果表明：DCC基因在結直腸癌組織中表達水平明顯降低，且其表達水平與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移有關，說明DCC為結直腸癌抑制基因，DCC基因表達缺失與結直腸癌的發生、發展、轉移呈正相關，所以DCC基因可能成為結直腸癌患者早期診斷、治療及判斷預后的一個生物學標志。

2 MKK4與結直腸癌的關系 絲裂原激活蛋白激酶4(MKK4)定位于人染色體17p11.2，可以編碼399個氨基酸殘基的蛋白質，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。MKK4能通過激活核因子κB抑制細胞凋亡，同時磷酸化并激活JNK及p38信號轉導通路，導致細胞增殖、分化及凋亡等，其突變致下游底物磷酸化，從而放大MAPK信號轉導。研究發現MKK4基因在肝癌[19]、卵巢癌[20]、肺癌[21]、鼻咽癌[22]中表達下調。本實驗結果表明：MKK4基因在結直腸癌組織中表達水平明顯降低，且其表達水平與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移相關，提示MKK4為結直腸癌抑制基因，與結直腸癌的發生、發展、轉移相關，所以檢測MKK4基因的表達對判斷結直腸癌的轉移及預測患者預后具有重要意義。