利用KASP分子標記技術輔助篩選多抗 番茄材料

李宗俊 王先裕 劉夢姣 崔馨月 趙 雄 陳 鵬 歐青青

（廣西大學農學院，廣西南寧530001）

廣西地區氣候潮濕、降雨量多、春秋季節常見陰雨天，在這種環境下番茄晚疫病（Tomato late blight）產生的致病疫霉（Phytophthora infestans）極易存活并侵染植株（鄭海武和李正英，2016）。番茄晚疫病是番茄上的常見病害，直接影響果實的產量與品質（路世竑，2018），每年減產10%～20%，嚴重時可以達到80%甚至絕產（陳宇飛 等，2000）。番茄晚疫病是由致病疫霉侵染所引起的一種真菌性病害，在廣西地區以A1 基因型為主要存在形式，優勢生理小種為T1，2和T1，2，3，4，5（朱桂寧 等，2007）。目前晚疫病主要通過合理調整栽培制度、使用特定的化學抑菌劑、種植含有抗性基因的品種等方式進行防治（鄭海武和李正英，2016），使用高抗晚疫病的品種是防治番茄晚疫病最為經濟有效的措施（李明遠，2017）。

番茄對晚疫病的抗性是典型的數量遺傳性狀，由Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4、Ph-5-1 和Ph-5-2等基因位點控制（胡明瑜 等，2018），對晚疫病的遺傳抗性已被證明可以減少晚疫病田間發病率，從而減少化學藥劑的使用（杜敏敏 等，2017）。在目前生產利用中，Ph-3 不僅抗多個生理小種并且在雜合狀態下也表現出較好的抗性，是較有優勢的一個基因位點（張春芝，2014）。利用分子標記等方式輔助常規育種技術進行抗病材料的篩選可以節省大量時間、人工成本，更加有利于我國抗病番茄產業的發展（杜敏敏 等，2017）。

本試驗通過將田間抗性鑒定與KASP（kompetitive allel-specif ic PCR）分子標記輔助選擇結合運用來高效篩選出田間表現為抗病且具有優良經濟性狀的番茄材料，從而為選育抗晚疫病的番茄優良新品種奠定一定基礎。

1 材料與方法

2018 年9 月初在廣西壯族自治區武鳴定標水庫旁番茄試驗基地進行大田試驗，10 月在廣西大學農學院園藝植物分子生物實驗室進行室內試驗。

1.1 試驗材料

參試的16 份番茄材料由廣西大學農學院番茄課題組提供，均為在連續多年發生晚疫病的試驗田中篩選收集的健康茂盛、經多代自交純化的番茄材料。其特性來源見表1。

表1 供試番茄材料及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取及KASP 分子標記檢測 DNA的提取采用CTAB 法，并且參考了番茄基因組DNA 的提取方法（劉秀麗 等，2017）。稱取0.2 g左右的新鮮番茄葉片置于研缽中，加入液氮研磨至泛白粉末狀，迅速轉移適量粉末至2 mL 離心管中，加入65 ℃ CTAB 提取緩沖液,充分搖勻后置于65 ℃恒溫水浴鍋加熱40 min，冷卻至室溫后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分搖勻后10 000 r · min-1離心10 min，提取上清液加入等體積氯仿/異戊醇，充分搖勻再10 000 r · min-1離心10 min，提取上清液加入醋酸鈉以及異丙醇，混勻后放入-40 ℃冰箱靜置30 min，在4 ℃條件下10 000 r · min-1離心10 min，棄上清液用75%乙醇洗滌沉淀2 次，晾干后加入TE 溶液溶解DNA，放入-40 ℃冰箱 待用。

使用蛋白質核酸分析儀檢測DNA 質量，以OD260/OD280在1.80～2.00 之間為宜。將DNA 送至北京通州國際種業科技有限公司，利用KASP 標記檢測SNP 位點。設計引物進行PCR 擴增，采用Douglas 軟件進行數據分析和基因型確認。

1.2.2 田間抗病性鑒定 2018 年12 月進行晚疫癥田間抗病性調查，采取五點取樣法調查番茄植株田間感病狀況，每個品種大約調查40 m2。將番茄晚疫病病情分為6 個等級（康立功，2006），具體 見表2。

病情指數（DI）=∑（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×最高級值）×100

高 抗（HR），0 ≤DI ＜10； 抗 病（R），10 ≤DI ＜30；中抗（MR），30 ≤DI ＜50；感病（S）：50 ≤DI ＜70；高 感（HS）：DI ＞70（康立功，2006）。

表2 番茄晚疫病病情分級標準

1.2.3 果實性狀測定 2018 年12 月，在番茄結果期每個品種隨機選擇5 株，在第3 穗果上采5～10個果實進行果實性狀測定。采用桂林量具刃具有限責任公司生產的0～150 mm 電子數顯卡尺測量番茄果實橫、縱徑，計算果形指數；采用竹村電機制作所生產的硬度計測定果實硬度；采用成都泰華光學有限公司生產的手持式折光儀測定果實含 糖量。

1.2.4 數據分析 利用Microsoft Excel、Word 以及SPSS 20.0 統計分析軟件進行試驗數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 番茄晚疫病抗性檢測結果

田間調查結果顯示（表3），16 份番茄材料中對晚疫病抗性較好的有10 份，其中LF-15、LF-35、LF-41、AL-21、AL-55 的病情指數均為0，表現高抗，LF-23 也對晚疫病表現高抗，LF-5、LF-7、LF-11、AL-51 表現為抗病。

田間晚疫病抗病性調查數據與分子標記試驗結果基本一致。根據KASP 分子標記檢測結果（表3、圖1～4），16 份材料中有3 份材料含晚疫病純合體抗性基因Ph-3，2 份材料含番茄黃化曲葉病毒病純合體抗性基因Ty-1，4 份材料含番茄黃化曲葉病毒病純合體抗性基因Ty-3，10 份材料含黃萎病純合體抗性基因Ve-2，LF-15、LF-35、LF-41 等3 份材料同時含有4 種抗性基因，其中LF-35 含有的4種抗性基因皆為純合體。

表3 番茄材料田間抗性調查與KASP 分子標記結果

圖1 番茄材料晚疫病抗性基因Ph-3 的KASP 分子標記檢測結果

圖2 番茄材料番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1 的KASP 分子標記檢測結果

圖3 番茄材料番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3 的KASP 分子標記檢測結果

圖4 番茄材料黃萎病抗性基因Ve-2 的KASP 分子標記檢測結果

2.2 番茄果實田間性狀調查

從表4 可以看出，16 份番茄材料中只有LF-30與AL-51 為有限生長型，其他材料皆為無限生長型；果形指數在0.79～1.03 之間，除LF-41 為高圓形外其他材料皆為扁圓形；果實硬度在0.56～0.81 kg · cm-2之間，AL-10 的硬度最高，AL-21 的硬度最低；LF-37、AL-1、AL-51 為中度裂果，LF-5、LF-66 不易裂果，其他材料無裂果現象；含糖量在4.0%～6.0%之間，酸甜比例合適；LF-5、LF-7、LF-35、LF-37、LF-41、AL-7、AL-51、AL-55 等8 份材料無果肩，其余材料皆有果肩。

3 結論與討論

本試驗從16 份番茄材料中篩選出3 份同時含有4 種抗性基因的材料LF-15、LF-35、LF-41，其中LF-35 的4 種抗性基因皆為純合體；這3 份材料皆為無限生長型，LF-41 為高圓形，LF-15、LF-35 為扁圓形，硬度皆在0.70 kg · cm-2以上，沒有裂果現象，含糖量在4.0%～5.5%之間，LF-15有果肩。3 份材料均具有十分優良的經濟性狀，可以為將來抗性育種篩選聚合多抗番茄材料提供更多 選擇。

本試驗使用第三代分子標記技術，利用KASP標記基于已知SNP 檢測來輔助番茄育種，大大節省了常規番茄育種的時間，提高了番茄抗病育種效率。在實踐過程中，由于第二代分子標記技術SSR 是基于凝膠條帶中的觀察，會出現操作觀察的錯誤，比如條帶顯色較弱或者條帶分離不完全等。與第一、二代分子標記技術不同，KASP 基因測定使用新型均相熒光檢測系統（Devran et al.，2016），該技術依賴于等位基因特異性單核苷酸延伸和熒光共振能量轉移（FRET）來產生信號，具有分布密度高、遺傳穩定性好、二等位基因型等特點，更容易實現高通量和自動化檢測（劉麗華 等，2018）。本試驗田間晚疫病抗病性調查數據與分子標記試驗結果基本一致，表明KASP SNP分子標記能夠顯著提高抗病育種中抗性基因的篩 選率。

綜上所述，新開發的KASP 標記在篩選番茄育種群體時顯示出一致的結果，將為在短時間內快速準確地分析許多樣品提供機會。然而，由于市場和消費者的需求，商業番茄品種的遺傳和物理特性迅速變化，因此未來KASP 標記應該在具有不同遺傳背景的番茄中進行測試，以確定大群體中標記的效率。在該研究之后，與番茄中的其他抗性基因相關的分子標記也可以轉化為KASP 技術，應用于分子標記輔助選擇以及抗病新種質的培育中。