南瓜熱激蛋白相關基因CmHSP70-5的 克隆和高溫脅迫下的表達分析

胡艷平 周 揚 楊 春 廖道龍 朱白婢 王 敏 黃文楓 張 文 云天海*

（1 海南省農業科學院蔬菜研究所，海南省蔬菜生物學重點實驗室，海南省瓜菜育種工程技術研究中心，海南海口571100；2 海南大學園藝學院，海南海口570228；3 海南省農業科學院，海南海口571100）

海南省具有得天獨厚的生態優勢和氣候條件，蔬菜栽培由來已久，是我國最主要的南菜北運基地。隨著人民生活和消費水平的不斷提高，迫切要求各種蔬菜作物實現周年生產和供應。但蔬菜作物在生長發育過程中常常會受到各種非生物脅迫的影響，其中高溫脅迫是影響其生長發育和產量的重要因子之一。蔬菜作物對于高溫脅迫的響應并非完全是被動的，其體內會產生相應的適應機制來降低脅迫造成的危害（韓笑冰 等，1997；葉陳亮 等，1997），以維持基本的代謝過程，甚至通過開啟某些基因或者酶的表達來緩解高溫帶來的危害（秦俊 等，2001；田婧和郭世榮，2012；閆圓圓 等，2016）。因此，通過研究蔬菜作物的耐熱機理，可以有助于人們培育出耐高溫的蔬菜新品種。

植物在進化過程中形成了許多應對高溫逆境的機制，包括基礎耐熱性和獲得耐熱性。當植物受到高溫脅迫時，一些基因被激活，從而導致一些代謝物和蛋白的含量增加，這些基因中有些可能會保護植物免受高溫脅迫的傷害，有些可能會激活某些特定基因的表達從而增強植物的耐熱性。目前已經克隆的與植物耐熱性有關的基因主要分為熱激蛋白（HSPs，heat shock proteins）、熱激轉錄因子（HSFs，heat stress transcription factors）、與膜穩定性、抗氧化和激素相關的基因等。熱激蛋白（HSPs）被認為是熱脅迫誘導的一類蛋白，其中包括：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和 small HSP（sHSP）（方麗平和李進步，2007）。Katiyar-Agarwal 等（2003）將擬南芥的hsp101 基因導入水稻，發現轉基因株系的耐熱性有一定程度的提高且產量穩定。將玉米ZmHSP22 基因轉化到擬南芥中，發現轉基因株系生育期縮短，同時耐熱性增強（Rhoads et al.，2005）。在擬南芥中過量表達菊花HSP70 基因可以增強植株對高溫脅迫的耐受性（Song et al.，2014）。將番茄熱激蛋白基因Lehsp100 反義敲除后，轉反義鏈的株系和對照相比耐熱性下降（Yang et al.，2006）。對海帶Sjhsp70 基因在溫度脅迫下的表達變化分析表明，高溫對Sjhsp70 的表達量具有顯著影響（袁艷敏 等，2018）。

南瓜起源于中、南美洲，包括30 個種，其中有5 個栽培種：中國南瓜（Cucurbita moschata）、美洲南瓜（C. pepo）、印度南瓜（C. maxima）、灰籽南瓜（C. mixta）以及黑籽南瓜（C. f icifolia）。不同南瓜品種的耐熱性差異較大，不耐熱品種在高溫季節及溫室栽培下容易受到高溫傷害。一般認為，中國南瓜廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區，生長發育的適宜溫度一般為18～32 ℃，具有較好的高溫適應性，但溫度超過35 ℃時，雄花易變為兩性花。海南地處熱帶邊緣，夏季太陽輻射強，平均氣溫在25 ℃以上，極端最高氣溫超過38 ℃，高溫嚴重制約著海南南瓜產業的發展。因此，開展南瓜對高溫脅迫的機理研究，對于篩選培育出耐熱的南瓜品種，豐富海南南瓜品種資源具有深遠意義。本試驗基于南瓜基因組的數據，從南瓜中分離1 個熱激蛋白相關基因CmHSP70-5，對其在高溫脅迫下的表達進行分析研究，以期為深入探討南瓜耐熱機理提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

于2018 年11 月選用海南地區廣泛種植的蜜本南瓜（Cucurbita moschata），將種子播種在裝滿基質（泥炭土∶蛭石=1 V∶1 V）的花盆中，放置在培養箱中生長，待長出3 片真葉后，進行37 ℃和42 ℃持續高溫處理，分別在高溫處理后0、3、6、12、24、48 h 取南瓜幼苗的根、莖、葉，用超純水清洗，然后用液氮速凍后立即放入-80 ℃保存以備提取RNA。整個試驗均在海南省瓜菜育種工程技術研究中心完成。

1.2 RNA 提取及反轉錄

采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit，目錄號：DP441）提取南瓜幼苗的RNA，采用寶生物工程（大連）有限公司的反轉錄試劑盒〔PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），目錄號：DRR047A〕進行反轉錄，具體操作步驟參照說明書。

1.3 基因克隆

從南瓜基因組數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Cucurbita+moschata） 中 獲得CmHSP70-5 基 因 的 序 列， 用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，引物序列為HSP70-5-F：5′-ATGGCAGCGAAAACTGAAG-3′，HSP70-5-R： 5′-TCAATCAACCTCCTCGATCTTC-3′。以 南 瓜cDNA 為模板，采用Vazyme 公司的2×Taq Master Mix（目錄號：P112）擴增，擴增產物經純化后連接到pEASY-T1（北京全式金生物技術有限公司，目錄號：CT101-01）載體上，挑取陽性克隆送往上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 實時熒光定量PCR

用Primer Premier 5.0 軟 件 設 計 南 瓜CmHSP70-5 基因的熒光定量引物，內標基因選用文獻報道中的Actin 基因（王安君 等，2016）。 引物由上海生工生物工程有限公司 合 成， 引 物 序 列 為：CmHSP70-qRT-F：5′-CGTTGCTTATGGTGCTGCTGT-3′，CmHSP70-qRT-R：5′-CTGTTCTTTCTTTGTTGGGATTGTT-3′；CmActin-F：5′-CGGCCATTGAGAAAAGCTACGAA CT-3′，CmActin-R：5′-CCCACCACTGAGGACGAT GTTACCA-3′。用未經高溫處理的根、莖、葉反轉錄得到的cDNA 為模板進行熒光定量PCR，研究CmHSP70-5 基因在不同組織中的表達差異；以高溫處理后不同時間的根、莖、葉cDNA 為模板進行熒光定量PCR，研究CmHSP70-5 基因在高溫脅迫下的表達模式。熒光定量PCR 采用TaKaRa 公司SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒（目錄號：DRR820A），在ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System 儀器上運行，Real-Time PCR 反應體系參照說明書進行。實時熒光定量PCR 反應條件：95 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，45 個循環；結束后讀取熒光信號：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s，進行熔解曲線分析。

采用比較CT 法來計算目的基因的相對表達量，目的基因的相對表達量=2-△△Ct，其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct內標基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內標基因）對照。試驗結果設3 個重復，取平均值進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 南瓜幼苗RNA 提取及反轉錄

將南瓜幼苗經過37 ℃和42 ℃高溫處理，分別在0、3、6、12、24、48 h 取其根、莖和葉片，用RNA 提取試劑盒提取各樣品的總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現RNA 質量較好，28S 和18S 較完整，且量較大（圖1）。按照說明書的操作方法取適量的樣品進行反轉錄，得到的cDNA 用南瓜內標基因Actin 進行PCR 檢測，從圖2 中可以看出，內標基因的擴增產物條帶單一，無雜帶，且亮度基本一致，說明cDNA 質量較好，可以進行后續試驗。

圖1 42 ℃高溫處理下根中的RNA

圖2 42 ℃處理下根中的cDNA 擴增產物

2.2 CmHSP70-5 基因克隆

從南瓜基因組數據庫中獲得CmHSP70-5基因（XM_023065965）的序列，將反轉錄的cDNA 混合作為模板，設計基因全長引物，擴增CmHSP70-5 基因，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為2 000 bp 的片段（圖3），將PCR 產物連接到T 載體后，篩選陽性克隆送往上海生工生物工程有限公司測序，確定CmHSP70-5 基因全長1 953 bp，測序結果與南瓜基因組數據庫中查到的序列完全符合，說明目的基因擴增正確。

圖3 CmHSP70-5 基因的克隆

利用MEGA7.0 軟件將CmHSP70-5 基因編碼的氨基酸序列與擬南芥HSP70 蛋白家族成員進行進化關系分析，發現CmHSP70-5 蛋白與擬南芥AtHSP70-5 的親緣關系更近（圖4）。

2.3 CmHSP70-5 基因在不同組織中的表達分析

提取未經高溫處理的南瓜幼苗根、莖和葉中的總RNA，采用熒光定量PCR 的方法研究這3 個組織中CmHSP70-5 基因的表達量。結果發現，CmHSP70-5 基因在根中表達量最高，葉片中的表達量次之，約為根中表達量的42%；莖中表達量最少，約為根中表達量的11%（圖5）。

圖4 CmHSP70-5 與擬南芥HSP70 家族蛋白的進化分析

圖5 CmHSP70-5 基因在南瓜幼苗不同組織中的表達

2.4 不同溫度脅迫下CmHSP70-5 基因在不同組織中的表達分析

2.4.1 不同溫度脅迫下根中CmHSP70-5 基因的表達模式分析 根中CmHSP70-5 基因在高溫脅迫下上調表達，處理后3 h 表達量達到最高，37 ℃處理3 h 后的表達量約為起始表達量的10 倍，42 ℃處理3 h 后的表達量約為起始表達量的16 倍，此后表達量降低，逐漸恢復到起始水平（圖6）。

2.4.2 不同溫度脅迫下莖中CmHSP70-5 基因的表達模式分析 雖然莖中CmHSP70-5 基因的起始表達量較低（圖7），但在高溫處理后，莖中CmHSP70-5 基因受高溫誘導上調表達，從圖7 中可以看出，處理3 h 后基因的表達量達到最大，且在高溫處理后0～24 h 內42 ℃處理的CmHSP70-5基因表達量要高于37 ℃同時期的基因表 達量。

圖6 根中CmHSP70-5 基因在不同溫度脅迫下的表達

圖7 莖中CmHSP70-5 基因在不同溫度脅迫下的表達

2.4.3 不同溫度脅迫下葉中CmHSP70-5 基因的表達模式分析 與莖中基因表達量相似，葉片中CmHSP70-5 基因在高溫處理3 h 后的表達量達最高，分別為起始表達量的1 800 倍（37 ℃）和2 860 倍（42 ℃）（圖8），說明葉片中CmHSP70-5基因的表達是一種高溫誘導模式。

圖8 葉中CmHSP70-5 基因在不同溫度脅迫下的表達

3 結論與討論

植物生長過程中，高溫是影響其生長發育的一種重要非生物脅迫，而且溫室效應導致全球氣溫升高，園藝植物生產面臨著嚴峻挑戰（范雙喜 等，2003）。因此研究植物耐熱性，培育耐熱植物新品種已經成為一項亟待解決的工作。植物的耐熱性是一個復雜的生理現象，是一個由多基因控制的數量性狀，包括熱激蛋白HSPs、熱激轉錄因子HSFs、抗氧化和激素相關基因等。在高溫脅迫下，植物細胞中會表達和積累大量的HSPs，從而避免或減輕植物受到熱損傷，HSPs 的積累量是由HSFs 控制的，并在植物熱激反應中發揮重要作用（Wang et al.，2004）。在所有的HSPs 中，HSP70家族蛋白是生物體內分布最廣和研究最多的一類。研究發現，HSP70 在植物生長發育和各類植物脅迫響應中至關重要（Sung et al.，2001；Swindell et al.，2007；Cho & Choi，2009；Zou et al.，2012；Kim et al.，2014）。擬南芥HSP70-1 定位于細胞質和細胞核中，與植物的耐熱性相關（Sung et al.，2001；Cazale et al.，2009）；缺 失HSP70-15 基 因的擬南芥突變體植株矮小、耐熱性下降（Jungkunz et al.，2011）；高粱HSP70 蛋白參與了其雄性不育系在不同溫度下的育性轉換（Chen et al.，1998）；葉用萵苣LsHsp70-2711 屬于Hsp70 基因家族，與葉用萵苣耐熱性相關（李雅博 等，2017）；蠟梅HSP70-1 基因在42 ℃高溫處理后1 h 表達量達到最高，說明其參與了高溫脅迫響應過程（阮文進， 2015）。

本試驗從南瓜中克隆到1 個HSP70 基因，系統進化樹分析發現其編碼的蛋白與擬南芥AtHSP70-5 蛋白的親緣關系較近，因此命名為CmHSP70-5。CmHSP70-5 基因在南瓜幼苗的各部位均有表達，運用熒光定量PCR 技術研究發現，CmHSP70-5 基因的表達受到高溫脅迫誘導，在一段時間內，溫度越高，表達量越高，這與其他植物中HSP70 基因的表達模式相似（Sung et al.，2001；Jungkunz et al.，2011；陳二龍 等，2018）。本試驗結果對開展南瓜耐熱機制研究以及耐熱南瓜的選育有積極意義。