家兔產氣莢膜梭菌的分離、鑒定及致病性分析

佘祿明

（松原職業技術學院，吉林松原 138001）

兔產氣莢膜梭菌病是由產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）感染引起的以腹瀉和脫水死亡為特征的一種急性傳染病（李天芝等，2019；史玉穎等，2018）。家兔是產氣莢膜梭菌的易感動物之一，兔產氣莢膜梭菌病可感染多個品種和年齡段，其中，對幼兔的危害最為嚴重，該病在幼兔中的發病率高達90%以上，死亡率為100%（馬愛華和朱鳳霞，2018；Tao等，2017；Zhao等，2017）。目前，該病已在山東、福建、重慶等20多個省市流行，該病的流行無明顯季節性，但在冬春多發（李達偉，2018；陳錫存，2017）。這可能與氣候、飼料等因素的改變有關，導致家兔產生應激反應，免疫力下降，腸道菌群失衡，促進產氣莢膜梭菌的快速繁殖，腸道中的毒素累積，誘 發 疫 病（Waleed等，2016；Hamd等，2006）。患病家兔常出現精神不振、食欲減退、腹脹、拉膠凍樣褐色稀糞等癥狀，最終脫水死亡（王曉麗等，2015）。

產氣莢膜梭菌為該病病原，又稱魏氏梭菌，是一種兩端頓圓，單個或成對排列，可產生芽孢的革蘭氏陽性菌，可產生多種毒素，對腸道危害最為嚴重，常形成壞死性腸炎和腸毒血癥，在自然界中分布廣泛（范國壽，2013；邢蘭君和劉輝，2012；黃生蓮等，2009）。產氣莢膜梭菌種類多樣，主要包括A、B、C、D和E型，其中A型最為常見且對動物危害最，嚴重，也是引起兔產氣莢膜梭菌病的主要類型。產氣莢膜梭菌的致病性主要與α、β、ε和τ、腸毒素和θ毒素等有關（呂長輝，2013）。目前，該病的防治方法主要為加強飼養管理與疫苗接種，但由于該病發病迅速，死亡周期短，家兔一旦發病，多數已無治療價值（do Carmo等，2018；李偉東，2009）。因此，開展兔產氣莢膜梭菌病的病原學研究十分必要，本研究針對家兔腹瀉死亡病例進行產氣莢膜梭菌的分離鑒定及致病性分析，為兔產氣莢膜梭菌病的防控提供理論依據，也為產氣莢膜梭菌疫苗候選株的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 10%兔鮮血平板由本實驗室提供，TSC選擇鑒別培養基購于北京陸橋有限公司，2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA marker、細菌基因組提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，細菌通用引物F1/R1由生工生物工程有限公司合成，引物序列為：

F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R1：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1.2 試驗動物及分組 試驗選取30日齡健康肉兔6只，隨機分為試驗組和對照組，每組3只。

1.3 病原菌的分離純化 取腸道內容物劃線接種于10%兔鮮血平板和TSC選擇鑒別培養基中，置于41℃恒溫培養箱中進行厭氧培養，并對純化的病原菌進行革蘭氏染色。

1.4 病原菌的分子鑒定 利用細菌基因組提取試劑盒提取純化后的病原菌基因組，進行PCR鑒定，反應體系為：DNA模板2 μL，上下游引物 F1/R1各 0.2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25μL，dd H2O 21.6 μL；反應條件：94℃預變性 3 min，94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 30s，35個循環，72℃延伸8 min，反應結束后，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將PCR產物送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.5 系統進化樹的構建 將16S rDNA基因序列測序結果在NCBI中進行比對分析，并基于病原菌16S rDNA基因序列，借助MEGA5.0軟件，利用N-J法構建系統的進化發育樹。

1.6 生化鑒定 挑取病原菌單菌落接種于營養肉湯中，培養24 h，取適量菌液分別接種于生化鑒定管中，對病原菌的生化特性進行鑒定。

1.7 致病性分析 用PBS將菌液濃度調整為109cfu/mL，試驗組肉兔通過腹腔注射稀釋后的菌液0.2 mL/只，對照組腹腔注射相同用量的PBS，正常飼喂，觀察記錄肉兔發病情況，同時剖檢死亡肉兔，并進行病原菌再分離。

圖1 革蘭氏染色結果

2 結果

2.1 革蘭氏染色結果 通過對病原菌的分離純化，分離到1株產氣莢膜梭菌疑似菌株，革蘭氏染色后發現，該菌為單個或成對排列的革蘭氏陽性菌，結果見圖1。

2.2 PCR鑒定結果 通過對病原菌16S rDNA基因序列的擴增發現，在1500 bp的位置出現單一條帶，經測序確定其大小為1450 bp，與預期結果一致，結果見圖2。

圖2 PCR鑒定結果

2.3 系統發育進化樹 將病原菌16S rDNA基因序列在NCBI中進行Blast比對分析發現，其與產氣莢膜梭菌的同源性最高（99%）。在系統進化樹中分離的病原菌與產氣莢膜梭菌聚為一簇（NCBI登錄號：Y12669.1），與梭菌屬的破傷風梭菌和肉毒梭菌處于不同分支，而與芽孢桿菌屬的凝結芽孢桿菌距離最遠，結果見圖3。

圖3 基于16S?rDNA構建的系統進化發育樹

2.4 生化鑒定 通過對病原菌的生化鑒定發現，山梨醇、吲哚實驗為陰性，其與檢測項目均為陽性。

表1 病原菌生化鑒定結果

2.5 致病性分析 通過腹腔注射將分離純化的病原菌攻毒肉兔，分析其致病性，發現實驗組在攻毒8 h后開始出現精神萎靡、四肢無力等癥狀，12 h開始出現死亡，并伴隨腹瀉癥狀，16 h后試驗組肉兔全部死亡，而對照組肉兔均正常。剖檢死亡肉兔發現，腸道出現彌漫性出血點，腸道內有脹氣，內容物呈水樣，腸黏膜有脫落現象，癥狀見圖4，對病原菌微生物進行再分離純化，發現腸道內容物中有大量病原菌，經分子鑒定，確定與攻毒菌株為同一株菌。

圖4 腸道病變

3 討論分析

產氣莢膜梭菌分布廣泛，可存在土壤、飼料、飲水和糞便中，也可存在于人或動物的體內，人和動物一旦感染極易發病。兔產氣莢膜梭菌病主要呈地區性流行或散發性發生，本病的流行無明顯的季節性，但在冬春兩季發病率較高。在飼養管理不當、飼料變更、氣溫變化、長途運輸等多種因素影響下，兔抵抗力下降，各種條件致病菌易誘發疫病，導致腸道菌群失衡，若此時家兔腸道中存在產氣莢膜梭菌，會在短時間內快速繁殖，分泌外毒素，引起家兔腹瀉，嚴重者導致死亡。本病的主要臨床癥狀為急性水樣腹瀉，發病初期糞便呈黑褐色，逐漸發展為黑褐色水樣或膠凍狀，后期發展為四肢癱軟，嚴重脫水，最終死亡。家兔感染后多在當日或次日發病死亡，少數周期較長，可達1周左右。呂長輝等（2013）利用劃線接種法進行兔產氣莢膜梭菌病例的病原菌分離時發現，肝臟病料中的產氣莢膜梭菌分離率較低，而通過肉湯培養的方法可從多數病料中分到產氣莢膜梭菌，提出產氣莢膜梭菌大多不是單純的腸毒血癥致病致死，腸道中的產氣莢膜梭菌可以突破腸黏膜屏障形成菌血癥。雖然上述方法可以有效分離肝臟中的產氣莢膜梭菌，但直接進行肉湯培養時會導致較多雜菌的繁殖，影響目標菌株的分離效果，因此，本研究以患病家兔腸道內容物為病料進行產氣莢膜梭菌的分離純化，成功分離到1株目標菌株。通過生化鑒定發現，病原菌的吲哚實驗為陰性，與寇敘等（2014）等的研究相反，存在差異性。通過對分離到的產氣莢膜梭菌致病性分析發現，家兔在攻毒8 h后出現精神萎靡、四肢無力等癥狀，16 h后全部死亡，而對照組肉兔均正常，表明所得菌株具有較強的毒性。楊軍等（2014）雖然對兔源魏氏梭菌的毒性進行分析，但僅以小鼠為動物模型，未研究出病原菌對本體動物的致病性。本研究對家兔產氣莢膜梭菌病進行了系統的病原分析與鑒定，明確了該兔場存在產氣莢膜梭菌，具有兔產氣莢膜梭菌病感染的風險，為兔場疫病防控指明了方向。

4 結論

對兔產氣莢膜梭菌病疑似病例中病原菌的分離鑒定，成功獲得1株兔源產氣莢膜梭菌，具有較強的致病性，為產氣莢膜梭菌致病機制的研究奠定了基礎，同時也為疫病診斷和防控提供理論依據。