利用微衛星標記分析興義鴨的遺傳多樣性

李志惠，李杰章，張依裕*

（1.貴州農業職業學院畜牧水產系，貴州清鎮 551400；2.貴州大學 動物科學學院，貴州貴陽 550025）

地方鴨種的研發一直是畜牧業的重要組成部分。目前，越來越多的畜禽品種資源出現不同程度的減少，究其原因還是我們對這些畜禽品種認識不夠深入，如興義鴨、納雍糯谷豬、長順綠殼蛋雞等（林家棟等，2008；焦仁剛，2008），加強對相關畜禽品種資源的研究是推動畜牧業可持續發展的有效途徑，也是加快從傳統地方畜禽養殖轉變為新型地方畜禽養殖的捷徑，為實現富農強農提供更多的參考。

微衛星由少數核苷酸（通常是以1～6個堿基為重復單位）組成的串聯重復序列，因其重復程度和次數的不同造就了微衛星具有高度多態性、在基因組中可以大量存在、均勻分布和變異強度大等優點，成為一種常用的分子標記方法，運用該方法可以迅速從基因組中選取微衛星序列并順序化，能高效率的使用PCR方法擴增和進行凝膠電泳的分析（盛巖等，2002）。段修軍等（2008）、馬洪雨等（2006）利用微衛星標記法在不同的畜禽領域取得了研究成果，本次試驗分析方法參照上述前輩的方法，運用微衛星標記分析興義鴨的遺傳多樣性，旨在加速興義鴨開發利用的進程，豐富地方鴨種的基因庫，更好地保護地方畜禽資源，既保障畜牧業的健康發展和相關產品的研發，同時也為地方畜禽的育種工作帶來一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 研究所采集的興義鴨樣本是經貴州大學動物科學學院出資，由貴州省金沙縣禹謨鎮的專業養殖戶提供養殖場地，在養殖過程中半封閉飼養，公母隔離，飼養過程中保持營養水平相同、飼養管理基本一致，將雛鴨（120只）喂養至10周齡，隨機選擇健康、體質好的興義鴨60只（♀：47只；♂：13只）翅膀靜脈采集血樣，-20℃保存備用。

1.2 微衛星引物 本研究采用20對引物的微衛星引物序列進行合成，合成公司為上海生物有限股份公司，各引物序列及退火溫度和片段范圍見表1。

1.3 基因組DNA提取 取常用的酚/氯仿抽提法來提取樣品中DNA，制備1%瓊脂糖凝膠，對提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V、20 min，在完成瓊脂糖凝膠電泳檢測后，運用紫外分光光度計測量DNA濃度已經足夠高，可用于完成后繼實驗，放置于-20℃的冰箱保存備用。

?表1 微衛星引物的序列及退火溫度

1.4 PCR反應與PCR產物檢測 聚合酶鏈式反應（PCR）體系：加入0.8 μl的DNA模板，上游引物和下游引物均各加1.1 μl，滅菌雙蒸水加6 μl，Ultra S8YBR Mixture（mixRox）加 11 μl，最終總體積為20 μl。建立PCR反應程序，預變性溫度是 95℃、5 min，變性溫度是 95℃、30 s，退火溫度是 60℃、50 s，72℃延伸 30 s，共 40個循環；72℃延伸10 min；10℃保存。PCR反應產物在進行PAGE凝膠電泳，電泳儀電壓設置為120 V、16 min，電泳完成后放置在凝膠成像儀上，觀察并截圖保存。

1.5 數據分析 根據條帶位置確定基因型，其中微衛星座位的有效等位基因數（Ne）由公式：計算。微衛星座位的等位基因頻率（P）由公式 ：Pi=[2（ii）+（ij1）+（ij2）+ …+（ijn）]/2N計算。微衛星座位的多態信息含（PIC）由公式。微衛星座位的基因雜合度（H）由公式

2 結果與分析

2.1 基因組DNA質量檢測 提取興義鴨血樣DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結果見圖1。由圖1可見，DNA完整性較好，NANODROP 2000 DNA濃度測定儀檢測結果顯示，OD260/OD280為 1.8～2.0。

圖1 鴨血基因組DNA檢測

2.2 微衛星座位的多樣性檢測 通過12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測微衛星座位的多態性，圖譜見圖2。由表2可知，20對微衛星引物均能擴增出特異性條帶，顯示出20對微衛星引物的均顯現出多態，部分引物擴增條帶呈現高度變異性，均可用于群體遺傳多樣性的評估。

圖2 AJ272580 和?AJ272579 引物 PCR?產物的電泳圖譜

2.3 微衛星基因座等位基因數及等位基因頻率根據各微衛星引物的擴增條帶和擴增片段大小范圍，統計其每個微衛星基因座等位基因數及等位基因頻率，結果顯示，在20對微衛星引物中共檢測到85個等位基因，平均每個微衛星基因座等位基因數4.2500個，AJ272580座位等位基因有7個，AJ272579和AJ272581座位等位基因各6個，AJ272582、AJ515884、AJ515887、AJ515890、AJ515893等位基因數均為5個，AJ272577、AJ272583、AJ515891、AJ515896、AJ515898、AJ515899等位基因數均為4個，AJ272578、AJ515883、AJ515889、AJ515895、AJ515900等位基因數均為3個，AJ515897座位等位基因最少，為2個。

2.4 微衛星基因座群體雜合度、多態信息含量和有效等位基因數 結果見表2，20個微衛星基因座群體雜合度中，位點AJ272580的群體雜合度最高，為0.8304，位點AJ515883的群體雜合度最低，為0.4919，其他的群體雜合度大多是在0.59～0.79之間，各位點平均群體雜合度為0.6850。多態信息含量最高的是位點AJ272580的0.8085，多態信息含量最低的是位點AJ515897的0.3733，其他的大多為0.50～0.77，各位點平均多態信息含量為0.6284。有效等位基因數最高的是位點AJ272580的5.8955，最低的是位點AJ515883的1.9681，其他大多為2.5～4.9，各位點有效等位基因數的平均值是3.4449。

3 討論

群體雜合度可以用于測定每個種群的遺傳變異，由表2可見，興義鴨的群體平均雜合度0.6850大于0.5，表明興義鴨的群體遺傳多樣性水平較大，可用于進一步選擇。常洪（2003）指出，在探討遺傳多樣性抽樣時，樣本的雌雄比是4∶1，且樣本數應達到60羽，符合前人要求，在凝膠判定基因型時條帶應清晰，上述要求本試驗基本達到。

表2 微衛星基因座群體雜合度、多態信息含量?和有效等位基因數

多態信息含量是評估物種遺傳多樣性的一個良好的指標，根據Botstein等研究結果，興義鴨AJ515883位點和AJ515897位點的PIC為0.25～0.5，表現為中度多態位點，剩下的18個微衛星位點的PIC均大于0.5，呈現出高度多態，興義鴨的平均PIC為0.6284均大于0.5，這20個位點均能用于反映出興義鴨的高度遺傳多樣性。要想較好的用做遺傳多樣性的評估，每一個微衛星位點的等位基因都應擁有4個以上，由微衛星基因座等位基因數及等位基因頻率結果可以看出，20個微衛星位點里只有AJ272578、AJ515883、AJ515889、AJ515895、AJ515897、AJ515900這 6個微衛星位點的等位基因都小于4，沒有呈現高度的多態，只表現出中度或低度多態。有效等位基因數也是標榜一個群體遺傳變異的尺子，有效等位基因數和等位基因的絕對數越相近，群體中等位基因的分布越平均，平均有效等位基因數為3.4449，表明20個微衛星基因數較大，其遺傳多樣性較豐富，人們就能有更好的能力來保持有效等位基因的選擇。

結合湯青蘋等（2006）的研究，影響最終試驗結果的原因包括所采集的樣本均由興義本地提供，由于當地交通不利，農產品也基本自給自足，導致興義鴨與外界鴨種的基因交流不暢，較好保留了其基因的完整性，所以試驗動物具有代表性，這項研究中對興義鴨的選育保種帶來了一份珍貴的參考資料。總而言之，結果表明，本試驗所用的20個微衛星位點都能用于鴨類遺傳多樣性的檢查。