不同堿度下普通小球藻對焦酚的響應研究

（河南師范大學水產學院，河南新鄉453007）

微囊藻是一類全球性分布的藍藻，在我國大部分富營養化水體中，銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)在數量和發生頻率上均占優勢[1]。銅綠微囊藻的大量繁殖不僅使水體溶解氧含量下降，破壞生態系統平衡，而且能釋放對其他生物有害的微囊藻毒素，是飲用水污染的來源之一，因此，抑制有害藍藻繁殖，控制水華暴發，已成為近年面臨的挑戰。普通小球藻(Chlorella vulgaris)是養殖水體的常見有益藻種之一[2]。小球藻生長旺盛并成為優勢種是良好水質的重要標志。因此，在漁業水體尤其是養殖水體中，如何有效抑制銅綠微囊藻等有害藍藻，促進普通小球藻等綠藻生長繁殖成為一個重要課題。

20世紀30年代以來，一些專家學者在水生植物分泌具有抑藻活性的物質篩選、提取和鑒定方面做了大量工作[3]。穗花狐尾藻是淡水湖泊中常見的沉水植物，Nakai等研究發現狐尾藻分泌的多酚化合物能抑制藍藻生長，并且進一步證明其中含有焦酚等多酚類物質[4]。盡管已有研究證明焦酚對藍藻較強的抑制效果，但對綠藻的影響還不清楚。我們的前期實驗發現堿度增加可促進焦酚對藍藻的抑制，不同堿度條件下綠藻對焦酚的響應還不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料及培養條件

實驗所用藻種普通小球藻來自中國科學院水生生物研究所培養物保藏中心淡水藻種庫。保種和實驗期間均用無菌BG11培養基，在2000lx，12h:12h光暗比，(25±1)℃的條件下培養。實驗所選化感物質焦酚購自Sigma-Aldrich公司(美國)，Folin-Ciocalteu試劑購自北京索萊寶科技有限公司(中國)。

1.2 實驗設計

實驗以綠藻中的普通小球藻為受試藻，設置焦酚處理組和對照組，處理組焦酚濃度均為5.0 mg L-1，分別設置0.38、1.51和6.04 mmol L-1等3個堿度水平，表示為0.38+、1.51+、6.04+。對照組堿度水平為0.38 mmol L-1，無焦酚添加。每組三個平行，實驗采用100 mL培養體系，試驗期間，每天早晚手動搖動錐形瓶各一次，促進營養循環，減少藻類下沉和貼壁效應。

在實驗開始后的第0、3、6、9天分別取樣測定各實驗組的藻細胞密度、培養液pH值，實驗開始和結束時測定培養液堿度。

1.3 指標測定

實驗的測定指標包括pH值、碳酸鹽堿度、碳酸氫鹽堿度、總堿度、以及普通小球藻細胞密度。其中，pH值采用酸度計測量，顯微鏡計數法測量藻細胞密度，堿度采用酸堿滴定法測定[5]。抑制率為對照組與處理組細胞密度差值占對照組的百分比。

2 結果

2.1 不同堿度水平下焦酚對普通小球藻的影響

圖1顯示，焦酚對普通小球藻的生長有一定影響，但不同堿度下影響程度不同。在0～6天，當堿度為0.38、1.51和6.04 mmol L-1時焦酚均能顯著抑制普通小球藻生長。在第6～9天，當堿度為6.04 mmol L-1時，焦酚不再抑制普通小球藻生長。從圖2可以看出，三種堿度在0～3天的抑制率均隨時間不斷增加，在整個實驗周期第3天的抑藻效果最好。6.04+實驗組在第3天抑制率達到最高。在第3～9天，0.38+、1.51+和6.04+實驗組的抑制率都有所下降，但6.04+實驗組下降幅度較大，在第9天，6.04+實驗組的抑制率為-3.0%，與對照組相比表現出對小球藻生長的促進作用。

圖1 不同堿度水平5 mg L-1焦酚作用下普通小球藻的生長曲線，0.38+、1.51+、6.04+分別表示堿度為0.38、1.51和6.04 mmol L-1的焦酚處理組，下同Fig.1 The growth curves of Chlorella vulgaris exposed to 5 mg L-1pyrogallol at different alkalinity levels,0.38+,1.51+and 6.04+respectively represent pyrogallol treatment groups with alkalinity of 0.38,1.51 and 6.04 mmol L-1.The same below

圖2 不同堿度水平下5 mg L-1焦酚對普通小球藻的生長抑制率Fig.2 The growth inhibition rate of 5 mg L-1 pyrogallol on C.vulgaris at different alkalinity levels

2.2 pH值和堿度的變化

實驗初期，每個實驗組的堿度不同，pH值也不同，堿度越大的實驗組，pH值越高。

從圖3可以看出初始堿度較大的實驗組，pH值較高。1.51+和6.04+實驗組由于實驗初期堿度較大，則pH值開始較大，但在第0～3天，pH值下降，第3～9天，pH值緩慢增加。1.51+和6.04+實驗組在第9天的pH值分別為8.53和9.14，低于第0天的pH值（8.83、9.44）。對照組和0.38+實驗組的pH值隨著暴露時間的增加逐漸增加，在整個試驗周期對照組的pH值大于0.38+實驗組。

圖3 不同堿度水平5 mg L-1焦酚作用下培養液中pH值的變化動態Fig.3 Changes of pH value in culture solution exposed to 5 mg L-1pyrogallol at different alkalinity levels

圖4表明了各實驗組中總堿度、碳酸鹽堿度和碳酸氫鹽堿度的變化情況，總堿度和碳酸氫鹽堿度的變化趨勢一致。在實驗第0天，對照組、0.38+、1.51+和6.04+實驗組的總堿度分別為0.40、0.40、1.46、5.99 mmol L-1，添加堿度和實測總堿度大致相同，對照組和0.38+實驗組只存在碳酸氫鹽，但是1.51+和6.04+實驗組，堿度由碳酸鹽和碳酸氫鹽組成。第9天，對照組、0.38+、1.51+和6.04+實驗組的總堿度分別為1.55、1.08、2.55、7.07 mmol L-1，對照組和0.38+實驗組同樣只存在碳酸氫鹽，并且碳酸氫鹽的堿度增加，1.51+和6.04+實驗組的碳酸鹽堿度降低，碳酸氫鹽堿度增加。在整個實驗周期碳酸氫鹽占主導地位，碳酸氫鹽堿度和總堿度的變化趨勢一致。

3 討論

近年來化感效應抑制水體中的水華藻類頗受關注，一些水生植物通過向水中分泌化感物質來抑制藻類生長[6]。焦酚是一種植物化感作用合成并釋放到環境中的帶有多個羥基的多酚類化感物，已有研究表明焦酚對藍藻中的銅綠微囊藻和綠藻中的小球藻都具有抑制作用[7]。但在不同堿度水平下焦酚對兩種藻的影響趨勢不同。隨著堿度的增加焦酚對銅綠微囊藻的抑制作用增強，但堿度為6.04 mmol L-1時，第9天的普通小球藻細胞密度大于對照組，焦酚不再抑制普通小球藻生長。銅綠微囊藻和普通小球藻分別為藍藻和綠藻的常見藻類，通過調節堿度水平進一步增強焦酚對藍藻的選擇性抑制，對有效控制藍藻水華意義重大。

溶解于水體中的無機碳共有4種存在形式：CO2、H2CO3、CO32-和HCO3-，它們之間存在著一定的動態平衡轉化關系。影響實驗組pH值變化的因素有2個作用相反的方面，分別是藻類光合作用吸收利用無機碳源（CO2和HCO3-）和藻類呼吸作用釋放CO2。藻類生長過程中，利用水體中游離態CO2和HCO3-進行光合作用，H+濃度減少，故pH值增大。而藻類呼吸過程釋放二氧化碳，pH值將下降。圖3中不同實驗組的pH值變化就是這兩個過程的綜合作用結果。pH值升高，表明這個時期普通小球藻生長旺盛，生長過程吸收利用二氧化碳和碳酸鹽對水中pH值的影響比呼吸過程釋放二氧化碳的影響大，pH值下降時作用機制則相反。

堿度是水體綜合性特征指標，代表能被強酸滴定的物質的總和，是金屬離子以及CO32-和HCO3-水解導致的pH值變化[8]。大多自然水體堿度為2.0～2.5mmol L-1，pH為6.5～8.5，呈弱堿性[9]。已有研究表明小球藻較適宜在弱堿環境中生長[10]，實驗表明，pH在7.17～9.14的范圍內普通小球藻的細胞密度均有不同程度的變化，pH從低到高，普通小球藻細胞密度呈拋物線變化，其中pH在9.14時達到最高，表明小球藻較適宜在弱堿環境中生長。所以實驗選取0.38、1.51和6.04mmol L-1的堿度，不僅有利于觀察不同堿度下普通小球藻對焦酚的響應機制，更有利于將此應用到自然水體的藻相調控。

4 結論

堿度水平會影響焦酚對普通小球藻的作用效果，0.38和1.51mmol L-1堿度水平下焦酚顯著抑制普通小球藻生長，暴露9天后抑制率分別為45.0%和 49.0%，而堿度為6.04mmol L-1時焦酚抑制率為-3.0%，普通小球藻細胞密度高于對照組。這與我們前期對銅綠微囊藻的研究結果不同，高堿度水平下焦酚對銅綠微囊藻抑制作用增強，對普通小球藻抑制作用減弱，為藍藻水華的選擇性生態控制提供了思路。