NLR、CRP、IL-2、BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b在乳腺癌診斷及預后中的應用

王述蓮 呼建民 李綿洋 王成彬

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，由于乳腺癌起病隱匿，早期病變難以發(fā)現，約70.0%的乳腺癌患者在首次就診時已屬晚期，使得生存率在30.0%以下[1～3]。現代研究表明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的過程，是由多因素、多階段、多步驟共同參與的過程[4，5]。乳腺癌的早期診斷與檢測有助于對乳腺癌高危人群進行普查、診斷、鑒別診斷及治療效果觀察，對病情判斷與預測預后都有重要的價值[6，7]。C反應蛋白(CRP)、白介素(IL-2)是反映炎癥應激作用的常見指標，在乳腺癌患者中多呈現高表達狀況。當前中性粒細胞和淋巴細胞絕對值的比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)作為評價惡性腫瘤病情與預后的因素也備受關注[8，9]。不過上述指標用于診斷乳腺癌的診斷敏感度和特異性較低，而且極易出現假陽性[10，11]。

我國乳腺癌患者約有8%屬于家族性乳腺癌，其中乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)的致病性突變僅為15%左右[12]。微小RNA (microRNA, miRNA)是一類長度為21～24個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA，可與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)進行配對結合，可調節(jié)mRNA的表達[13]。當前許多與肺癌相關的miRNAs已得到了實驗證實，如與肺癌早期診斷相關的miR-145、miR-21、miR-10b等，與正常對照組比較，其在肺癌患者血清中的表達水平均顯著升高[14]。本研究探討了NLR、CRP、IL-2聯(lián)合標志物(BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b)在乳腺癌診斷及預后中的應用，以期能建立一種有效的診斷乳腺癌與預測預后的方法。現總結報道如下。

資料與方法

1.研究對象:采用回顧性總結研究2016年2月～2018年5月選擇在筆者醫(yī)院診治的乳腺癌患者60例(癌變組)、良性乳腺腫瘤患者60例(瘤變組)與健康人60例(對照組)。納入標準：筆者醫(yī)院倫理學委員會批準了此項研究；所有入選者的臨床病例資料完整；都有明確的病理檢查結果；患者年齡20～80歲；檢測前未接受過手術、激素、放射治療、化學治療等治療；入選者在自愿條件下簽署了知情同意書。排除標準：妊娠與哺乳期女性；臨床資料與病理學資料缺項者；合并其他系統(tǒng)腫瘤病史；合并心臟、肺、肝臟、胃等重要臟器的疾病。對照組：年齡28～77歲，平均年齡58.33±3.11歲，平均體重指數22.48±1.28kg/m2。瘤變組：患者年齡29～78歲，平均年齡59.11±2.87歲，平均體重指數22.10±2.19kg/m2。癌變組：患者年齡28～77歲，平均年齡58.23±4.11歲，平均體重指數22.83±1.23kg/m2；臨床分期：Ⅱ期34例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例；淋巴結轉移：無轉移45例，有轉移15例；分化程度：低分化21例，中分化19例，高分化20例。3組的年齡、體重指數比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.檢測指標與方法：采集所有入選者的空腹肘靜脈全血3～6ml，平分為3份，第1份樣本采用離心機在4℃ 離心后(3000×g離心10min)，取上清，采用免疫熒光法檢測CRP、IL-2水平，檢測設備是i400免疫發(fā)光檢測儀(德國羅氏公司)。第2份樣本采用不進行抗凝，采用全自動血液分析儀檢測外周血中的血小板、中性粒細胞、淋巴細胞值，計算NLR。第3份樣本不進行抗凝，提取血液基因組DNA與RNA，采用實時PCR檢測總RNA中miR-145、miR-21、miR-10b含量。miR-145引物為5′-CATCTTACTGGGCAGCATYGGA-3′，miR-21引物為5′-CGT-CTTTACCCAGCAGTGT-3′，miR-10b引物為5′-ATCGAAAGTACTGGACTTT-3′。采用實時PCR檢測總DNA中的BRCA1表達水平，BRCA1引物為5′-ATTTGGCCTAGCTCCTAA-3′。PCR過程：95℃ 10min酶活化，后續(xù)40個循環(huán)，95℃ 15s，延伸60℃ 1min，60～95℃下進行溶解曲線分析，以Ct值≤27為陽性。

3.隨訪方式:隨訪采用電話、信訪相結合的方式，了解癌變組患者的生存情況。

結 果

1.CRP與IL-2水平比較:癌變組的血清CRP、IL-2水平高于瘤變組與對照組，瘤變組高于對照組(P<0.05),詳見表1。

表1 3組血清CRP與IL-2水平比較

與瘤變組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.NLR值比較:癌變組的NLR值低于瘤變組與對照組，瘤變組低于對照組(P<0.05),詳見表2與圖1。

表2 3組NLR值比較

與瘤變組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

圖1 3組NLR值比較

3.BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b陽性率比較:癌變組血液中BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b陽性率高于瘤變組與對照組(P<0.05),詳見表3。

表3 3組血液BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b陽性率比較 [n(%)]

與瘤變組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

4.隨訪預后:隨訪至今，癌變組中患者死亡6例，存活54例，病死率為10.0%。

5.乳腺癌臨床指標與臨床病理特征、治療預后的相關性:癌變組60例患者中，隨著淋巴結轉移、分化程度減少、病理分期增加與隨訪死亡，BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b表達陽性率顯著增加(P<0.05),詳見表4。

6.影響因素分析:在癌變組60例患者中，以預后死亡作為因變量，以檢測指標與病理學特征為自變量，多因素Logistic回歸分析淋巴結轉移、臨床分期、組織學分化、BRCA1、miR-145、miR-21都為影響患者預后死亡的主要獨立危險因素(P<0.05),詳見表5。

表4 乳腺癌臨床指標與臨床病理特征、治療預后的相關性[n(%)]

表5 影響乳腺癌患者預后的影響因素 (n=60)

討 論

乳腺癌是目前最常見的女性惡性腫瘤之一，發(fā)生率在我國逐漸增加。特別是很多患者早期癥狀隱匿，缺乏有效的敏感而特異的早期診斷方法，多數的患者就診時已是晚期，預后比較差。當前乳腺癌的病因尚不十分清楚，其中經歷了多步驟、多階段、多因素、多基因變異參與的復雜的生物學演變過程，發(fā)病機制非常復雜[15]。

CRP是由肝細胞分泌合成的急性期反應蛋白，IL-2是免疫細胞分泌的重要炎性反應標志物之一。正常情況下，血液中的CRP、IL-2水平較低，當機體出現炎癥或惡性腫瘤時，血液中的CRP、IL-2水平會顯著上升[16]。本研究顯示，癌變組的血清CRP、IL-2水平高于瘤變組與對照組，瘤變組高于對照組(P<0.05)，表明兩者可以作為乳腺癌的一種診斷指標，其主要作用機制與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。中性粒細胞分泌大量的血管內皮生長因子，刺激毛細血管增生，有助于腫瘤細胞的生長及轉移；其也可產生活性氧和細胞因子殺傷腫瘤細胞[17]。并且淋巴細胞參與機體的免疫反應，可直接殺傷腫瘤細胞；淋巴細胞減少提示機體抗腫瘤免疫力下降，為腫瘤提供生長環(huán)境。本研究顯示癌變組的NLR值低于瘤變組與對照組，瘤變組低于對照組(P<0.05)。從機制上分析，隨著腫瘤的發(fā)生、進展，機體炎癥與抗腫瘤之間失去平衡，可降低NLR降低；同時炎性反應可刺激腫瘤分化，從而促進腫瘤的增殖，形成一種惡性循環(huán)[18]。

近年來，隨著分子遺傳學和分子生物學的研究與不斷發(fā)展，當前許多研究者越來越深入對乳腺癌在分子水平致癌機制進行了研究。相關研究表明BRCA1的表觀丟失或表達位置變化可能造成散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生。BRCA1屬抑癌基因，可以通過p53促使細胞周期抑制因子p21的表達；BRCA1蛋白還能快速定位并通過同源重組和非同源末端連接等途徑修復損傷DNA，阻止受損細胞進入下一周期以調控細胞周期[19]。相關研究表明BRCA1的甲基化和相關突變導致BRCA1蛋白表達下調時，對細胞周期的調控及抑癌作用減弱，可促使腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[20]。miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，miRNA可通過靶向調控多種靶基因及信號通路影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。當前包括乳腺癌在內的許多腫瘤組織中均可發(fā)現miRNA表達失調的現象，如肺癌、胃癌、腸癌等。比如miR-145、miR-21、miR-10b可通過多種信號轉導途徑而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但是具體的機制還不明確。本研究顯示癌變組血液中BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b陽性率高于瘤變組與對照組(P<0.05)。相關研究表明miRNA還可以促進免疫活性介質的釋放來參與腫瘤的免疫調控，miR-21、miR-10b可下調腫瘤細胞表面的細胞內黏附分子-1的表達水平，從而降低機體的免疫功能；miR-145可以阻礙了免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別能力[21]。

炎癥抑制與血常規(guī)指標能在一定程度上反映出乳腺癌患者的病情，但是預測預后的價值有限。本研究隨訪至今，癌變組中患者死亡6例，存活54例，病死率為10.0%；隨著淋巴結轉移、分化程度減少、病理分期增加與隨訪死亡，BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b表達陽性率顯著增加(P<0.05)。有研究顯示乳腺癌患者NLR水平≥3～4時與高復發(fā)危險和高病死率相關，治療前乳腺癌患者NLR水平升高其預后較差[22]。BRCA1基因突變的乳腺癌患者具有獨特的臨床病理，BRCA1陰性家族性乳腺癌患者具有較低的腫瘤分級。文獻報道m(xù)iR-145、miR-21、miR-10b可能參與了腫瘤細胞中PI3K途徑的激活；miR-10b可能通過影響乳腺癌MCF-7細胞的增殖、凋亡及周期分布而發(fā)揮促癌作用[23]。

BRCA1與腫瘤的惡性程度、腫瘤侵襲性、復發(fā)性、轉移、大小等密切相關，在散發(fā)型乳腺癌中約30%的患者伴有BRCA1表達水平升高，腫瘤直徑越大、臨床分期越晚、組織學級別越高，BRCA1蛋白表達率越高。本研究多因素Logistic回歸分析淋巴結轉移、臨床分期、組織學分化、BRCA1、miR-145、miR-21都為影響患者預后死亡的主要獨立危險因素(P<0.05)。 miRNAs在乳腺癌的血管生成方面也發(fā)揮了重要作用，豐富的miRNAs可影響并修飾基質細胞，募集腫瘤相關的基質細胞，從而促進腫瘤的發(fā)生與進展。不過任何單一的指標對檢測乳腺癌的效果都不能十分滿意，而指標的聯(lián)合檢測有助于提高乳腺癌的早期診斷準確率。

綜上所述，NLR、CRP、白介素-2聯(lián)合BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b在乳腺癌中呈現異常表達情況，與乳腺癌的病理特征與隨訪預后密切相關，可應用乳腺癌輔助診斷與預后預測。