膿毒癥患者外周血HMGB1、TLRs水平與應激性潰瘍的相關性

陸 剛 張 羽 張學敏

膿毒癥(sepsis)是指由細菌或真菌等病原體毒素釋放并引發全身炎癥綜合反應的病癥，并以機體免疫系統激活并活化多種炎性因子進而導致組織器官、免疫系統等發生損害為主要病理特征[1]。其發病機制尚未完全闡明。研究顯示膿毒癥可進一步發展為重癥膿毒癥或多器官功能障礙綜合征(MODS)，甚至膿毒癥休克，而MODS等引發機體處于應激狀態導致應激性潰瘍的發生[2]。因而探尋預測膿毒癥發展為應激性潰瘍的相關生物學指標對延緩或控制病情發展具有重要意義。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可調節多種生物病理生理過程并參與機體炎性反應或腫瘤形成過程[3]。機體特異性/非特異性免疫過程中Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)充當重要蛋白分子，可識別病原相關分子模式的受體，同時TLRs介導的信號轉導通路對機體調節炎癥免疫反應發揮重要作用[4]。關于HMGB1、TLRs在膿毒癥發生應激性潰瘍過程中的作用研究尚未見報道，因此本研究主要探討膿毒癥患者外周血HMGB1、Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)水平與應激性潰瘍的相關性，為臨床早期預測應激性潰瘍提供參考依據。

資料與方法

1.一般資料:選取2016年8月～2017年4月筆者醫院收治的62例膿毒癥患者與71例嚴重膿毒癥患者作為研究對象并分別設為膿毒癥組與嚴重膿毒癥組，且均分別符合相關診斷標準[5,6]。膿毒癥組中男性34例，女性28例，患者年齡為42～72歲，平均年齡63.25±10.54歲，嚴重膿毒癥組中男性32例，女性39例，患者年齡為42～73歲，平均年齡64.13±10.69歲。入院后根據所有患者臨床資料與多器官功能障礙綜合征(MODS)評分，將患者發生應激性潰瘍作為陽性組(76例)，未發生應激性潰瘍作為陰性組(57例)[7]。另選取同期健康體檢志愿者58例為對照組，其中，男性30例，女性28例，年齡為40～71歲，平均年齡62.34±10.39歲。各組年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：近期未服用影響免疫功能藥物者；未患有血液疾病者；受試者知情且簽署同意書。排除標準：自身免疫異常性疾病者；合并冠心病等嚴重疾病患者；合并其他惡性腫瘤患者；慢性肝臟、腎臟疾病終末期患者；臨床資料不全者。

2.方法：(1)制備外周血單個核細胞：無菌條件下采集受試者清晨空腹外周靜脈血3ml，并置于EDTA抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，并以3000r/min轉速離心20min，將分離得到的PBMC置于-20℃冰箱中保存待用。(2)實時熒光定量PCR法檢測外周血HMGB1、TLR2與TLR4表達量：采用Trizol試劑盒(北京百泰克公司)提取PBMC總RNA，并將RNA反轉錄為cDNA。運用Primer 4.1引物設計軟件HMGB1引物序列，TLR2與TLR4引物詳見表1。實時熒光定量PCR按照SYBR Green Master(德國Qiagen公司)說明書操作，每組樣品設3個復孔并置于實時熒光定量PCR儀上進行反應，程序為95℃預變性1min，95℃ 15s，60℃ 60s，共40個循環，HMGB1、TLR2、TLR4均以GADPH為內參基因，并采用2-ΔΔCt算法計算HMGB1、TLR2、TLR4相對表達量。(3)檢測病情相關指標:抽取所有膿毒癥患者空腹靜脈血3ml，離心后吸取血清并采用酶聯免疫吸附法(ELSA)試劑盒檢測白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、炎性介質降鈣素原(PCT)，所用儀器為美國Bio Tek全自動熒光酶標免疫測定儀。采用放射免疫法檢測患者血清胃泌素(GAS)，并按照試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)操作，對所有患者均進行急性生理學及慢性健康狀況評分(APACHEⅡ)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

結 果

1.3組受試者外周血HMGB1、TLRs表達量比較:膿毒癥組患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平均顯著高于對照組(P<0.05)，嚴重膿毒癥組患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平均顯著高于膿毒癥組(P<0.05)，詳見表2。

表2 3組受試者外周血HMGB1、TLRs表達量比較

與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05

2.陽性組與陰性組患者外周血HMGB1、TLRs表達量比較:陽性組患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平顯著高于陰性組(P<0.05)，詳見表3。

表3 陽性組與陰性組患者外周血HMGB1、TLRs表達量比較

3.陽性組、陰性組患者臨床指標的比較:觀察并比較陽性與陰性組患者臨床指標，陽性組前炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8與氧化應激指標NO、MDA及PCT、hs-CRP、GAS水平及APACHEⅡ評分均顯著高于陰性組(P<0.05)，而SOD水平顯著低于陰性組(P<0.05)，詳見表4。

4.Logistic分析膿毒癥患者發生應激性潰瘍的相關因素:將影響膿毒癥患者發生應激性潰瘍的因素進行Logistic分析，膿毒癥患者外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平是膿毒癥患者發生應激性潰瘍的獨立影響因素，詳見表5。

5.ROC分析HMGB1、TLRs對應激性潰瘍的診斷價值:ROC分析檢測HMGB1、TLRs水平對應激性潰瘍的診斷價值，HMGB1的敏感度為71.05%、 特異性為91.23%、截斷值為3.86；TLR2的敏感度為73.68%、特異性為73.68%、截斷值為3.87；TLR4的敏感度為65.79%、特異性87.72%、截斷值為4.63，詳見圖1、表6。

表4 陽性組、陰性組患者臨床指標的比較

表5 膿毒癥患者發生應激性潰瘍的相關因素的Logistic分析

圖1 膿毒癥患者外周血HMGB1、TLRs對應激性潰瘍的ROC分析

表6 膿毒癥患者外周血HMGB1、TLRs對應激性潰瘍的ROC分析

檢測指標AUC標準誤Z95% CIPHMGB10.8660.03111.872 0.796～0.9190.000TLR20.7650.0416.505 0.684～0.8340.000TLR40.8110.037 8.3010.734～0.8730.000

討 論

膿毒癥主要是指損傷或感染引起宿主發生免疫及炎性反應，嚴重時可引發多器官功能障礙甚至應激性潰瘍[8]。機體內炎癥或氧化應激反應可損害細胞對氧的利用效率并對組織器官造成損傷[9]。目前關于膿毒癥發生機制尚未完全闡明，以往研究報道指出HMGB1與晚期糖基化終產物受體(RAGE)及TLRs可參與炎性疾病發生過程并發揮致炎作用[10～12]。本研究將通過檢測膿毒癥患者外周血HMGB1與TLRs水平并探究其與應激性潰瘍發生的關系，為進一步明確膿毒癥發病機制提供參考依據。

HMGB1作為炎性因子可參與體內炎性反應，HMGB1與受體RAGE/TLRs結合是引發炎癥疾病的重要通路[13]。核轉錄因子κB(NF-κB)可在應激性與炎性反應等過程中發揮重要功能，研究表明HMGB1與受體結合可活化NF-κB信號通路并促進炎性因子合成及釋放進而參與多種組織器官病理及生理過程[14]。本研究結果顯示膿毒癥組患者外周血HMGB1水平明顯升高，且嚴重膿毒癥組顯著高于膿毒癥組，陽性組顯著高于陰性組，說明膿毒癥患者HMGB1水平顯著升高且隨病情加重其表達水平升高更顯著。NF-κB信號轉導途徑活化后可促進炎性因子表達導致氧化應激反應的發生進而促進疾病發展，而GAS水平可反映機體應激狀態并可作為應激性潰瘍發生的重要指標[15～17]。本研究結果顯示陽性組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8與NO、MDA、PCT、hs-CRP、GAS水平均顯著高于陰性組，而SOD水平顯著降低，提示膿毒癥患者外周血HMGB1水平升高可影響前炎因子與氧化應激指標等表達水平進而參與膿毒癥進展為應激性潰瘍的過程。

TLRs家族中TLR2、TLR4位于細胞表面并可引發機體免疫過度反應進而導致感染性與慢性炎性疾病的發生，現多以TLR2、TLR4作為防治疾病的重要靶點。TLR2、TLR4可加快心肌收縮性有關炎性蛋白分泌并引發充血性心力衰竭等疾病。研究表明TLR2、TLR4均可識別脂多糖并引發機體炎性反應并促進疾病發展進程[18]。本研究結果顯示膿毒癥組患者外周血TLR2、TLR4水平均顯著高于對照組，嚴重膿毒癥組顯著高于膿毒癥組，進一步分析顯示陽性組顯著高于陰性組，說明膿毒癥與應激性潰瘍患者外周血TLR2、TLR4水平均顯著升高且隨著疾病嚴重程度的增加而顯著升高。

本研究分析應激性潰瘍患者臨床指標的變化，結果顯示陽性組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、NO、MDA、PCT、hs-CRP、GAS水平及APACHEⅡ評分均顯著高于陰性組，而SOD水平顯著低于陰性組，提示HMGB1與受體TLR2、TLR4結合并激活NF-κB信號通路而促使炎性因子等分泌增加進而在膿毒癥發生及應激性潰瘍發生過程中發揮重要作用。同時Logistic分析顯示膿毒癥患者外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平是發生應激性潰瘍的獨立影響因素，并將影響膿毒癥發展為應激性潰瘍的獨立影響因素進行ROC分析，結果顯示HMGB1、TLR2、TLR4均具有較高的敏感度與特異性，提示HMGB1、TLR2與TLR4均可作為應激性潰瘍的預測因子。本研究結果揭示外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平升高與膿毒癥患者應激性潰瘍的發生密切相關，且均可參與疾病發生、發展并可作為預測膿毒癥患者病情的重要指標。

綜上所述，外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平高低可能成為膿毒癥疾病嚴重程度及應激性潰瘍發生的重要指標，為臨床對應激性潰瘍的預測提供依據。