SPOCK1在大腸癌組織中表達的研究

畢丹丹 成秉林 李寶華 陳曉宇 張淑君

大腸癌(colorectal cancer，CRC)的發生率在惡性腫瘤中高居第3位，大腸癌患者死亡人數占所有惡性腫瘤死亡人數的8%左右，早期發現大腸癌的患者只占所有大腸癌總患病人數不到1%[1]。目前手術是結直腸癌的主要治療手段，手術切除后的5年生存率平均可達40%～60%，然而術后的局部復發、遠處的轉移卻成了大腸癌患者死亡的最主要原因[2]。因此，提高大腸癌預后效果的關鍵在于如何盡早發現、診斷大腸癌并對其開展規范化的手術治療。

細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是一種非細胞成分，存在于組織和器官中，蛋白多糖和纖維蛋白是其主要的兩種分子成分。ECM中的大分子被肽酶分解，使其不斷地處于動態的重塑狀態，保持組織的分化和穩態。肽酶的異常改變以及ECM的分解與合成之間平衡的破壞，都可以使ECM的動態平衡發生明顯的改變，進而導致腫瘤的發生。SPOCK1是一種由細胞產生并分泌到細胞間質中的ECM蛋白多糖，直接參與ECM的構成，同時也是新發現的鈣離子結合蛋白多糖家族成員之一，對ECM的合成及積累起到了重要的調節作用，同時也可抑制肽酶的活性。近年來，因其具有促進腫瘤形成、抑制腫瘤凋亡、促進腫瘤侵襲和轉移、調節ECM重構等生物學作用而備受關注與研究。

材料與方法

1.標本來源:收集2014年7月1日～2015年5月31日哈爾濱醫科大學附屬第四醫院普外科手術切除的19例新鮮大腸癌組織及癌旁組織標本，每例標本取2塊，將其中一塊標本迅速放于-80℃冰箱中凍存，用于實時熒光定量PCR檢測SPOCK1 mRNA；將另一塊標本制成相應的石蠟標本。連同收集2007年7月1日～2012年2月28日病理科庫存的大腸癌及其癌旁石蠟標本35例，共54例石蠟標本切片進行免疫組化。54例患者均出生于黑龍江省，其中男性33例(61.1%)，女性21例(38.9%)；患者年齡<60歲23例(42.6%)，患者年齡≥60歲31例(57.4%)；結腸癌41例(75.9%)，直腸癌13例(24.1%)；腫瘤直徑<5cm 39例(72.2%)，腫瘤直徑≥5cm 15例(27.8%)；大體類型為潰瘍型42例(77.8%)，隆起型10例(18.5%)，平坦型2例(3.7%)；組織學分級為低分化13例(24.1%)，中分化35例(64.8%)，高分化6例(11.1%)；有淋巴結轉移20例(37.0%)，無淋巴結轉移34例(63.0%)。所有患者均為首次發現，未接受過放療和化療，并且由資深病理醫生進行病理診斷和分級，實驗中標本均設相應的癌旁組織為對照。

2.主要試劑與儀器：主要試劑中Trizol購自上海TaKaRa公司，反轉錄試劑盒購自康為世紀公司，實時熒光定量PCR 試劑盒購自康為世紀公司，SPOCK1、GAPDH上下游引物由上海生工工程公司合成，兔抗人多克隆抗體SPOCK1購自武漢三鷹生物技術公司，抗兔二抗購自北京中杉金橋公司，DAB濃縮顯色液購自北京中杉金橋公司。主要儀器中real-time-PCR儀產自上海羅氏制藥有限公司，低溫高速離心機產自德國Eppendorf公司，超凈工作臺產自美國Thermo公司，制冰機產自日本Sanyo公司。

3.SPOCK1 mRNA表達:采用實時熒光定量PCR方法檢測大腸癌中SPOCK1 mRNA的表達。用Trizol分別提取19例新鮮組織標本中的總RNA，并反轉錄為cDNA。SPOCK1上游引物：5′-CAACTGCTTGTTCCCAGAGG-3′，下游引物：5′-GCCAATGACTTCCC TATCCA-3′，產物長度109bp；GAPDH 上游引物：5′-CAGGAGGCATTGCTG ATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGGCTGGGGCTCAT TT-3′，產物長度為138bp。根據Ultra SYBR Mixture試劑盒操作說明書加樣：加入2×Ultra SYBR Mixture為1×10-5L；加入上游引物，10μmol/L為5×10-7L；加入下游引物，10μmol/L 為5×10-7L ；加入Template DNA 為8×10-7L；加入RNase-Free Water 為8.2×10-6L。反應體系為20μl，35～40個循環，預變性95℃ 10min；變性95℃ 15s；退火/延伸 60℃ 1min；溶解曲線分析95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s、60℃ 15s。采用2-△△Ct分析法，Ct值是每個反應管里的熒光信號達到所設定域值經歷的循環數，按照公式計算，擴增的GAPDH作為內參，將每個分組都設為3個復孔。△Ct=Ct平均值(目的基因)-Ct平均值(內參)；△△Ct=△Ct實驗組-△Ct空白對照組。

4.免疫組織化學檢測SPOCK1蛋白表達:54例大腸癌石蠟標本采用免疫組織化學SP法檢測大腸癌SPOCK1蛋白的表達。標本經中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4μm組織切片。經脫蠟、梯度水化后采用檸檬酸高溫高壓修復4min，放至室溫。在3%H2O2中常溫孵育0.5h，目的是將內源性過氧化物酶的活性消除。非特異性抗原被山羊血清封閉0.5h之后，滴入1∶100比例的兔抗人多克隆抗體SPOCK1，放入4℃濕盒中過夜。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3min×3次。在抗兔二抗工作液37℃中孵育0.5h，用PBS溶液沖洗3min×3次。最后用DAB進行顯色、蘇木素進行復染、中性樹膠進行封片。

5.免疫組化結果判定標準:SPOCK1表達陽性的染色反應呈現棕黃色，隨機抽取5個高倍鏡視野。A：計算陽性細胞占腫瘤細胞的百分比，陰性計0分，0～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，80%～100%計4分。B：按高比例陽性表達細胞所呈現染色強度進行計分，陰性的計0分，弱陽性的計1分，陽性的計2分，強陽性的計3分。根據陽性表達的細胞數和著色的強度得出綜合性的判斷，兩者相乘計分，乘積結果分別為0、1、2、3、4、6、9、12分，其中0～2分計為SPCOK1蛋白陰性表達，≥3分計為SPOCK1蛋白陽性表達。

結 果

1.SPOCK1 mRNA表達:SPOCK1 mRNA在大腸癌組織中表達明顯上調，與癌旁組織比較，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 SPOCK1 mRNA在大腸癌與癌旁組織中的表達

2.SPOCK1蛋白表達：SPOCK1屬于分泌型蛋白，其分泌到細胞間質中參與ECM的構成，主要表達于胞質， 陽性染色為棕黃色，呈顆粒狀(圖2)。54例大腸癌標本中SPOCK1蛋白的表達水平顯著升高，與正常組織中的表達比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。并且SPOCK1的陽性表達和大腸癌組織學分級呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)；而與年齡、性別腫瘤部位、腫瘤直徑、大體類型、淋巴結轉移、浸潤深度、遠處轉移無關，差異無統計學意義(P>0.05,表1)。

圖2 SPOCK1免疫組化染色A.SPOCK1在大腸癌組織中表達(×100)；B.SPOCK1在大腸癌組織中的表達(×400)；C.SPOCK1在癌旁組織中表達(×100)；D.SPOCK1在癌旁組織中表達(×400)

圖3 SPOCK1蛋白在大腸癌與癌旁組織中的表達

表1 SPOCK1陽性著色和臨床病理學資料關系

臨床病理特征nSPOCK1陽性表達χ2P年齡(歲) <6023210.647>0.05 ≥603126性別 男性33272.048>0.05 女性2120腫瘤部位 結腸癌41350.422>0.05 直腸癌1312腫瘤直徑(cm) <539340.003>0.05 ≥51513大體類型 潰瘍型4237 隆起型1092.201>0.05 平坦型21組織學分級 低分化1313 中分化353329.9<0.05 高分化61淋巴結轉移 有20191.785>0.05 無3428浸潤深度 漿膜/漿膜外48432.483>0.05 未穿透漿膜64遠處轉移 有870.002>0.05 無4640

3.SPOCK1蛋白的表達與大腸癌臨床病理學參數的關系：SPOCK1表達陽性率在低分化大腸癌組織中為100%(13/13)，在中分化組織中為94.3%(33/35)，在高分化組織中為16.7%(1/6)，差異有統計學意義(χ2=29.9，P<0.05)，詳見表1。

討 論

許多惡性腫瘤患者術后無法達到很好的預后效果，甚至出現死亡的原因是腫瘤細胞具有轉移和侵襲能力。腫瘤細胞的侵襲和轉移會經歷以下幾個步驟：腫瘤細胞之間黏附性改變，使原發灶脫落，脫落的腫瘤細胞分泌酶降解并穿過ECM屏障，侵入淋巴管和血管，并隨著血流在周圍組織或遠端器官中建立新的腫瘤細胞集落[3]。因此在腫瘤侵襲和轉移過程中，ECM屏障被降解是重要步驟，只有ECM屏障被降解，腫瘤細胞才能侵入血管，隨著血流轉移到其他器官[4]。

SPOCK1是一種ECM蛋白多糖，SPOCK1蛋白的發現是研究者提取睪丸精液中94000的蛋白多糖，為了檢測其主要成分，卻無意中發現了一個序列，命名為testican，而后改名為SPOCK1。編碼此蛋白的SPOCK1基因定位于人染色體5q31區域，含硫酸軟骨素鏈及硫酸乙酰肝素鏈，其mRNA 長度為5kb，包含12 個外顯子，開放閱讀框架長1.3kb， 3′端非編碼區長達3.3kb，約為其他基因非編碼區的4倍，并編碼SPOCK1蛋白的439個氨基酸殘基。SPOCK1的同源基因為SPOCK1，含有6個功能區域，部分區域能抑制蛋白酶活性。研究表明其第3號外顯子可以被選擇性地分解，從而發揮特定的靶向功能。SPOCK1同時又屬于鈣離子結合蛋白多糖家族的成員，共同特點是有著相似的N端、C端和含有卵泡素樣結構的區域，并參與細胞的增殖、黏附及轉移。蛋白多糖家族除了SPOCK1之外還包括SPARC、testican-2及testican-3。

近期研究發現，SPOCK1不僅在食管鱗狀細胞癌、膽囊癌、肝癌、肺癌及胰腺癌中有高表達，而且其表達的程度也與腫瘤的組織學分級、淋巴結轉移及患者的短期存活時間有明顯的相關性。特別要強調的是，經統計學分析證實，SPOCK1不僅可以作為膽囊癌患者的一個預后指標，也可以對胰腺癌和肝癌的預后起到一定的參考價值[5,6]。研究發現，SPOCK1在前列腺癌中表達量較高,特別在已經出現轉移的情況下癌組織SPOCK1表達量更高；同時研究發現SPOCK1能促進前列腺癌的增殖，抑制其凋亡，在膠質母細胞瘤、肝癌、尿路上皮癌、卵巢癌的侵襲和轉移中也能發揮一定的促進作用[7～13]。此外，研究表明SPOCK1的高表達會影響胰腺癌及乳腺癌的預后[14～16]。

本研究通過熒光定量PCR檢測到SPOCK1基因在癌變組織中的表達明顯高于正常組織中，同時應用IHC檢測到大腸癌中SPOCK1蛋白也同樣高表達，表明SPOCK1也許能促進大腸癌的發生、發展。經進一步研究發現，SPOCK1明顯和大腸癌的組織學分級呈正相關。雖然在研究SPOCK1與大腸癌患者臨床特征中，SPOCK1和淋巴結轉移相關性不明顯(P=0.915)，但是考慮到納入研究的標本量有限，提高研究的標本量或許能有新的發現。SPOCK1作為分泌型蛋白，可以在組織中被靈敏的檢測出來，SPOCK1或許可以作為大腸癌早期檢測的生物學標志物。筆者下一步重點要研究SPOCK1在大腸癌中是如何發揮促進腫瘤形成、抑制腫瘤凋亡作用的。