蛋白質互作技術研究進展

盧艷艷 王超 侍福梅

摘要：蛋白質作為細胞活性及功能的執行者，以復雜有序的動態互作協調著細胞的增殖與分化、衰老與死亡以及環境應答等各種重要生理過程。重點介紹了酵母雙雜交系統、雙分子熒光互補、噬菌體展示技術、熒光共振能量轉移技術、谷胱甘肽巰基轉移酶融合蛋白沉降技術、免疫共沉淀技術等蛋白質互作研究技術的原理及在生物學中的應用，以及生物信息學在蛋白質互作研究中的應用，并對目前及未來蛋白質互作技術的發展方向進行了探討。

關鍵詞：蛋白質;生物信息;蛋白質互作

中圖分類號：Q51? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）12-0005-06

Abstract： Proteins，the true executer of cell activities and functions， play important roles in the proliferation， differentiation， aging and death， and environmental response via complex and highly ordered dynamic interaction. The basic principles and applications of several related research techniques in protein-protein interactions， including yeast two-hybrid system， bimolecular fluorescence complementation assay， phage display technology， fluoresence energy transfer， GST Pull-down， co-immunoprecipitation， and bioinformatics in protein interaction research applications， and their development prospects were also prospected.

Key words： protein; bioinformatics; protein interaction

2003年4月，人類基因組測序的完成，標志著生命科學正式進入后基因組時代，生命科學從單純研究基因序列信息轉向對基因功能的深入解析，蛋白質組學成為研究熱點。蛋白質不能單獨發揮作用，需依靠蛋白質與蛋白質之間的相互作用發揮功能。蛋白質與蛋白質之間相互作用即蛋白質互作（Protein-protein interaction，PPI）是細胞生化反應網絡的一個重要組成部分，在新蛋白質及相關蛋白質復合物的發現、鑒定與功能驗證，以及細胞信號轉導、細胞代謝等研究方面發揮了關鍵作用，成為蛋白質組學研究的重要區域。通過PPI發現，當細胞凋亡發生時不同的熱激蛋白質家族成員都廣泛參與凋亡信號通路[1];線粒體抗病毒信號蛋白質（MAVS）作為一種接頭蛋白質在調節宿主天然免疫信號通路過程中扮演著重要角色[2]。

蛋白質本身是多種多樣的，每種蛋白質的獨特生理屬性影響著蛋白質間的相互作用，在體外試驗分析重組蛋白質的表達，會導致機體內內含物的形成從而妨礙其功能的實現[3]。蛋白質間的互作也存在不同層次的復雜性，如：多亞基酶的納米機制[4]、分子伴侶與靶蛋白質的互作[5]、蛋白質激酶與靶蛋白質互作[6]、代謝網絡中多種蛋白質的互作[7]。因此，完全精準解讀蛋白質的相互作用原理及功能，需要更加高效科學的PPI技術。

1? 蛋白質互作技術

隨著生物技術的不斷發展，PPI技術得到了極大改善，試驗過程變得簡化，試驗結果更加準確。目前PPI技術主要包括酵母雙雜交（Yeast Two-hybrid）系統、雙分子熒光互補（Bimolecular Fluorescence Complementation Assay，BiFC）、噬菌體展示技術（Phage Display Technology，PDT）、熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）技術、胱甘肽巰基轉移酶融合蛋白沉降（Glutathione S-transferase Pull-down Assay，GST Pull-down Assay）技術、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技術和Far-western blotting等多種研究PPI的技術。

1.1? 酵母雙雜交系統

酵母雙雜交是1989年由Fields等[8]首次應用在真核生物酵母轉錄因子GAL4特性的研究中。酵母雙雜交技術是建立在模式生物酵母之上，原理是酵母細胞起始基因轉錄需要有轉錄激活因子的參與，其在結構上是組件式的，有2個特殊的結構域：DNA結合結構域（DNA Binding Domain，DNA-BD）[9]和轉錄激活結構域（Transcription Activation Domain，AD）[10]，DNA-BD和AD單獨存在沒有轉錄激活功能。將2個蛋白質基因分別連接到BD與AD區域，若它們在空間上無限接近，則會形成復合物，轉錄激活因子恢復活性，功能激活，BD區域可識別酵母轉錄激活因子上游激活序列（Upstream Activation Sequence，UAS），轉錄產物激活UAS下游的報告基因使之轉錄[11]，根據報告基因的表達與否可以判斷PPI的結果，進而測得未知蛋白質的功能。

酵母雙雜交系統對蛋白質之間的微弱、瞬間作用敏感度較高，因此在許多生物學研究領域得到廣泛應用[8，12]。李明智等[13]利用酵母雙雜交系統篩選水稻組蛋白質去乙?；窰DA705的互作蛋白質，為進一步揭示HDA705的生物學功能提供了關鍵線索;Silva等[14]利用酵母雙雜交技術驗證了磷蛋白質與磷酸酶1之間的相互作用;陳澤良等[15]應用酵母雙雜交技術初步篩選出與埃博拉病毒VP24、VP35、VP40相互作用的宿主蛋白質，并完成了初步功能分析。

酵母雙雜交系統是研究蛋白質互作的所有方法中較為簡便、靈敏和高效的一種方法[16]，但仍存在一些局限性。傳統的酵母雙雜交只能檢測發生于核內的相互作用[17];在試驗中，經常遇到假陽性，并且其轉化效率不高，仍需進一步優化。目前，酵母雙雜交系統衍生出了單雜交系統、三雜交系統、核外雙雜交系統、反向雙雜交系統、哺乳動物雙雜交系統等技術[18]，未來酵母雙雜交系統在生物學研究領域尤其是生物醫藥領域中的應用將更加深入。

1.2? 雙分子熒光互補

雙分子熒光互補（BiFC）是在2002年由Hu等[19]提出的一種觀察植物活細胞間PPI的方法。BiFC是基于兩段不完整的熒光報告蛋白質互補片段重新結合成完整的報告蛋白質，并發出熒光的過程。該試驗為觀察活細胞中蛋白質間的相互作用和修飾提供了一種有效的方法。

BiFC技術的原理是利用熒光蛋白質基因的某些特定位點，將其切成2個不具熒光活性的N-端和C-端2個片段，使2個片段分別與目標蛋白質基因連接，構建重組表達載體，然后轉染細胞融合表達，如果2個目標蛋白質存在相互作用，便能夠相互接近，重新形成具用熒光活性的蛋白質，從而發射熒光，反之，目標蛋白質之間則沒有相互作用。

自從Ghosh等[20]報道了綠色熒光蛋白質（Green Fluorescent Protein，GFP）通過N-末端和C-末端的重新組裝產生綠色熒光以來，BiFC技術得到很大的改進和發展。例如，多色熒光互補技術（Multicolor）能夠研究多種蛋白質間的相互作用。隨著BiFC技術的完善，在生物學研究中的應用逐漸增多。曹建美[21]利用BiFC解析了玉米MAPK5與bZIP72蛋白質之間的相互作用;劉文曉等[22]在活細胞中通過BiFC直接觀察研究MICOS復合物中各組成蛋白質之間的相互作用關系;Chen等[23]通過BiFC檢測了HIV-1與輔助因子蛋白質以及上皮衍生生長因子之間的相互作用，其相互作用顯著，這項研究提供了新的蛋白質生理條件下的成像系統，并為抵抗HIV病毒的蛋白質抑制劑類藥物研發提供信息。到目前為止，已經有超過10種BiFC分析技術的熒光蛋白被發現。在活細胞Ca2+依賴蛋白質互作的研究中，黃色熒光蛋白質（Yellow Fluorescent Protein，YFP）的有效性首次被證明[24]，紅色熒光蛋白質DsRed[25]被發現后關注較多，因為DsRed的應用延長了BiFC分析的波長范圍。

在一般情況下，BiFC技術相比其他PPI分析熒光互補試驗具有幾個獨特的優勢[26，27]：BiFC可以研究未知結構信息的蛋白質間的相互作用，幾乎可以對任何需氧生物通過基因改造表達融合蛋白質。BiFC復合物發射的熒光可以利用熒光顯微鏡、流式細胞分析儀等檢測，不需要精密儀器、數據處理和利用試劑把融合蛋白分開。完整細胞的研究避免了在細胞分解過程中發生PPI的變化以及不同細胞隔室內容物的混合，既可對單個細胞中的PPI進行觀察，也可以對不同細胞中不同細胞過程的差異進行研究。但是該技術也存在局限性，受到熒光基團形成時間和熒光蛋白復合物穩定性的限制。

1.3? 噬菌體展示技術

噬菌體展示技術（PDT）最早是Smith[28]在1985年提出的，用絲狀噬菌體作為載體進行分子生物學研究，并首次介紹了PDT。PDT是以噬菌體作為載體，利用基因工程技術將外源DNA片段連接到載體上，使外源DNA隨噬菌體衣殼蛋白質結構基因一起表達，形成融合表達蛋白質，展示在噬菌體表面的一項分子生物學技術。

PDT是通過外源基因與噬菌體結構基因融合表達（不影響結構基因的活性），形成具有相對空間結構和生物活性的融合蛋白質，展示在噬菌體表面，利用靶標蛋白質，通過生物淘選的方法，使與靶標蛋白質特異結合的噬菌體被篩選出，然后利用篩選的噬菌體侵染大腸桿菌進行擴增，再進行序列測定分析，獲得目的蛋白的功能信息，為下一步研究提供理論依據。

噬菌體技術廣泛應用于驗證PPI、臨床應用[29]，抗體工程分離技術[30]，疫苗開發[31]等方面。目前的PDT包含各種噬菌體的載體，包括M13、T7、T4和f1。而近幾年的有關報道也充分證明了噬菌體展示技術的廣泛應用：利用噬菌體表面展示技術從人肝癌T7 cDNA文庫中篩選出能與人CD8～+T淋巴細胞特異結合的蛋白分子[32];通過PDT技術制備出來的流感病毒、蛇毒等的特異性中和抗體[33];利用T7噬菌體展示技術篩選與人腸道病毒71型3A蛋白相互作用的蛋白質[34];運用PDT篩選到了可用于多菌型麻風病患者及潛在患者診斷的3段多肽[35]等。盡管PDT成本低、操作簡單，但也存在一定的局限性，如噬菌體庫容量和分子多樣性有一定的限制，且文庫一旦建成，很難突變和重組，因而文庫中分子遺傳多樣性受到限制，細胞內有毒分子很難得到表達。

1.4? 熒光共振能量轉移技術

1948年由F？觟rster等[36]提出了熒光共振能量轉移這一理論，與GFP的應用和改造使FRET技術得以在活細胞中廣泛應用。1992年Prasher等[37]首次從維多利亞水母中分離并克隆了一種熒光物質——GFP，后來，更多的熒光蛋白（CFP、BFP、YFP等）被發現，為FRET的實現提供了基礎。FRET是一種非輻射的能量轉移，可以定時、定量、定位、動態地觀察活細胞內蛋白質與蛋白質之間的相互作用[38]。

以最常用的CFP、YFP為例，簡單介紹FRET原理。CFP發射光譜與YFP的吸收光譜存在重疊，兩者距離足夠近時，CFP的吸收波長激發，CFP的發光基團把能量共振轉移到YFP的發光基團，CFP因此發射的熒光減弱（消失），YFP發射熒光，2個熒光基團能量轉移對空間位置的變化感應非常靈敏。若要研究A、B蛋白間的相互作用，可以依據FRET的原理構建融合蛋白質系統，該系統包括CFP、B蛋白質、YFP。當A、B蛋白存在互作時，CFP和YFP在空間上足夠接近而發生能量轉移，YFP發射熒光，反之，則CFP發射熒光。

FRET技術在細胞生理研究、免疫分析和蛋白質組學研究中的應用有許多成功的報道。曹薇薇等[39]研究發現，通過FRET技術在活細胞生理狀態下，可以實時動態監測TGF-β1/Smad3信號轉導通路的過程;Mizutani等[40]首次將依據FRET原理設計的可檢測BCR-ABL激酶活性的基因編碼生物傳感器應用于臨床;FRET技術也陸續用于一些腫瘤藥物的研發，如胰腺癌[41]、乳腺癌[42]等的抗癌藥物。FRET技術具有分析速度快、方法靈敏度高、選擇性好、無污染或污染小等優點，使其在包括細胞生理研究和蛋白質組學研究及臨床相關的藥物分析等領域應用日益廣泛[43-46]。

1.5? GST Pull-down技術

1988年，Smith等[47]利用谷胱甘肽-S-轉移酶（Glutathione S Transferase，GST）融合標簽從細菌中進一步純化出GST融合蛋白質。GST Pull-down是一個行之有效的體外驗證PPI關系的試驗技術，其既可以驗證已知蛋白質的相互作用，還可以篩選與已知蛋白質互作的未知蛋白質，現已經廣泛用于分子生物學領域[48]。

GST Pull-down的原理是通過利用基因工程技術將目的蛋白質基因與GST基因融合表達產生誘餌蛋白質，將該誘餌蛋白質溶液通過帶有GTH（Glutathione）的層析柱，誘餌蛋白質與GTH結合，然后將待測蛋白質溶液過柱使它們反應，再用洗脫液洗脫，如果目的蛋白質與待測蛋白質間不存在互作，則開始時便被清洗出來，反之，則用洗脫液才能得到待測蛋白質。GST Pull-down的應用范圍也很廣泛。朱彤等[49]通過GST Pull-down驗證植物體內NRP（具有響應脅迫并會引起細胞凋亡的一個蛋白質）與Fy PP3（一種PP6型的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶）之間具有相互作用。Luo等[50]對GST Pull-down技術進行了優化改進，使該技術的應用更加簡便快捷。GST Pull-down技術與其他蛋白質互作技術的結合使用，試驗結果會更加準確可信，Tran等[51]運用GST Pull-down技術、雙向凝膠電泳和質譜分析法完成了DNA結合蛋白質的鑒定。

GST Pull-down技術方法簡單易行、操作方便。缺點是無法大規模篩選蛋白質間的相互作用，且有些內源性蛋白質會干擾試驗導致假陽性結果。相信在未來GST Pull-down技術與其他PPI技術的聯合使用驗證蛋白質之間的相互作用將會發揮更大的作用。

1.6? 免疫共沉淀技術

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種研究特定蛋白質之間相互作用的理想方法，其可以確定活細胞內蛋白質的相互作用。該方法依靠抗原與抗體特異性結合原理鑒定蛋白質間的相互作用。

Co-IP技術的原理是細胞在溫和、非變性條件下裂解時，細胞內許多完整的蛋白質-蛋白質間的相互作用保留了下來，隨后加入與目標蛋白質對應的抗體使之發生免疫共沉淀反應形成抗原-抗體復合物沉淀，然后通過電泳分離、質譜鑒定，再對這些蛋白質復合物進行分析，以確定新的結合性伙伴、結合親和力、結合動力學和目標蛋白質的功能。該技術既可以用來確定胞內蛋白質的結合，也可以用于發現新的蛋白質互作而形成的復合物。

目前，Co-IP技術在蛋白質互作方面的應用有了很大的發展。楊亮等[52]利用免疫共沉淀技術驗證SET與eEF1A1在人肝細胞內的相互作用;Skieterska等[53]利用Co-IP技術鑒定了GPCR的二聚化作用;孫婷婷等[54]利用免疫共沉淀聯合質譜分析方法，在人肝癌細胞系細胞株HepG2內篩選與肝細胞核因子（HNF）3β相互作用的蛋白質。Co-IP技術與其他PPI技術（如GST-Pull down、酵母雙雜交系統等）相比具有其特有的優勢，它可以鑒定活細胞內蛋白質間的自然結合，規避了外界因素，因此鑒定的蛋白質可信度高。Co-IP與其他PPI技術的聯合使用可以有效提高試驗的準確率。Co-IP技術也存在一定的局限性，如對低親和力的蛋白質互作檢測效率低、鑒定的蛋白質之間可能不是直接的互作、靈敏度受目標蛋白質濃度限制、抗體制備也比較復雜且昂貴等。

1.7? Far-western blotting

Far-western blotting是由Western blotting發展而來的研究PPI的一種技術。在Far-western中通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目的蛋白質樣品，固定到硝酸纖維素膜上，然后利用非抗體蛋白質來探測目標蛋白質[55]。Far-western blotting的原理是將樣品蛋白質用非變性PAGE膠分離，將電泳后的蛋白質轉膜，封閉膜、洗膜，加入待測蛋白質使其與膜上蛋白質相互作用，然后加入帶有標記（如HRP）的待測蛋白質的抗體一同孵育，將膜和標記（如HRP）的底物一起孵育進行顯色，分析試驗結果。

近幾年Far-western blotting技術得到不斷改進完善，該技術被廣泛應用。蘇婧等[56]通過Far-western blotting從正常人肝組織中篩選出乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原PreS1結合蛋白質，為HBV的感染致病機理的闡述提供了理論依據;Li等[57]研究了在細菌黏附和侵入中起重要作用的層黏連蛋白質（LN）和纖連蛋白質（FN）間的相互作用。Machida等[58]使用GST標記的SH2結構域作為探針，檢測在細胞信號傳導磷酸化過程中與SH2結構域相互作用的蛋白質分子。Far-western blotting的優點是方法簡便、快捷、靈敏度較高、假陽性低，在蛋白質組學中得到廣泛應用;主要缺點是它至少需要一種一定量的純化蛋白質，并且存在不可避免的非特異性合。

1.8? 細胞骨架的蛋白質互作技術

細胞骨架的蛋白質互作技術（Cytoskeleton-based Assay for Protein-Protein Interaction，CAPPI）是2017年由美國加州大學戴維斯分校柳波教授團隊開發的一種依賴于細胞骨架而研究PPI的新方法[59]，是利用細胞骨架的直觀性，通過煙草葉片瞬時表達系統建立的一種技術，用于活體細胞生理環境中蛋白質互作的檢測。CAPPI技術操作簡單，不需要復雜的光學操作和計算過程，有望應用于更多的蛋白質類型。CAPPI技術在未來還有廣闊的應用領域和提升空間，該技術的廣泛應用及不斷優化將有力地推動PPI研究的進展。

除上述介紹的一些蛋白質互作技術之外，還有等離子表面共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技術、蛋白質芯片（Protein Chip）技術、串聯親和層析（Tandem Affinity Purification，TAP）技術、細胞內共定位（Cellular Colocalization）技術等。

2? 生物信息學（Bioinformatics）在蛋白質互作中的應用

生物信息學是20世紀80年代末開始，隨著人類基因組計劃（Human Genome Project，HGP）的啟動而興起的一門新的學科[60]。此技術主要研究蛋白質、核酸等生物大分子[61]，是一門由生物學、化學、物理學、數學、信息科學和計算機科學等多學科交叉產生的新興學科[62]，主要依賴于生物信息學數據庫對海量的生物信息進行集中綜合、管理、儲存、分析和傳播，利用計算機技術及軟件處理發布，方便人們進行查詢使用。

隨著生物信息學的迅速興起，生物信息學技術在蛋白質組學研究上的應用也越來越深入。研究人員將國內外的部分涉及蛋白質互作和生物信息學相關的蛋白質組數據庫進行了整合[63，64]，生物信息學在蛋白質互作中應用的生命科學研究探索取得了顯著成果。葛金濤等[65]利用生物信息學工具和方法對葡萄miR159家族成員進行分析，來研究葡萄miR159基因家族在葡萄生長發育過程中發揮的作用;李漢成等[66]檢測甲基苯丙胺依賴大鼠和健康大鼠血清外泌體中微小RNA（miR）-181a-5p的表達，并對miR-181a-5p進行靶基因預測及相關生物信息學分析;路東曄等[67]對沙柳LAS基因RT-PCR技術成功克隆的SpsLAS基因進行生物信息學分析表明，沙柳LAS基因與番茄LS、擬南芥LAS等功能已確認的LS亞家族基因同源性較高，氨基酸相似性達50%以上，說明了LAS基因對于木生植物側生分生組織同樣有重要影響。

生物信息學主要特點是信息量大、數據更新快、內容復雜、傳播途徑網絡化[68]。利用生物信息學探究PPI技術，實現信息共享，為今后更為全面、便捷﹑詳盡地探索生命科學奠定了一定的信息化基礎。

3? 展望

近年來PPI研究發展迅速，其應用也愈加廣泛，如在基因治療中，可建立基因組蛋白質連鎖圖，確定多肽類藥物的作用靶點[69]，針對一些疾病的治療有了新的突破方向。當前的PPI技術存在一些假陽性干擾，對于正確認識蛋白質有一定影響，而且有些技術耗資大、耗時多、耗用人力大，對試驗條件要求比較高，還不易得出準確的結果。每種技術都有各自的優缺點，有些可以優勢互補，因此可以多種技術結合，優化體系，盡量減少干擾，進一步提高結果的準確性。針對具體的應用，優化整合互補不同PPI技術對解決當前存在的一些技術缺陷，進一步完善優化PPI技術具有很重要的意義。

結合生物信息學的優勢進一步對目標蛋白質進行預測、建模等分析，同時輔助有效的蛋白質互作技術可以提高效率，節約成本，為蛋白質組學的發展貢獻力量。

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收稿日期：2019-01-20

作者簡介：盧艷艷（1991-），女，山東聊城人，在讀碩士研究生，研究方向為模式植物細胞蛋白互作，（電話）17852267227（電子信箱）