1株耐硒凝結(jié)芽孢桿菌的分離鑒定及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

吳美儒　周毅峰　唐巧玉

摘要：用含硒培養(yǎng)基，采用平板稀釋分離法，從湖北恩施漁塘壩高硒環(huán)境中分離鑒定1株凝結(jié)芽孢桿菌。為確定該凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，采用單因素和正交試驗法對凝結(jié)芽孢桿菌的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件（碳源、氮源、溫度和轉(zhuǎn)速）進行了優(yōu)化，為確定其培養(yǎng)時間作出了生長曲線。結(jié)果表明，溫度對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響最大，其后依次為氮源、碳源和轉(zhuǎn)速;最適培養(yǎng)基為：葡萄糖11 g/L，牛肉浸膏11 g/L，氯化鈉5 g/L;最適培養(yǎng)條件為：溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min;（2）從生長曲線可看出，0～1.5 h為停滯期，1.5～10 h為對數(shù)生長期，10～20 h為穩(wěn)定期，最佳培養(yǎng)時間為10 h。

關鍵詞：硒;凝結(jié)芽孢桿菌;分離;培養(yǎng)條件;生長曲線

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0256-04

硒是人體和動物所必需的微量元素[1]，湖北省恩施州是世界著名的典型高硒區(qū)，蘊藏十分豐富的硒資源[2]。對硒資源的開發(fā)利用目前主要依靠植物對硒的富集作用，得到富硒農(nóng)產(chǎn)品和含硒提取物如硒蛋白、硒多糖等。微生物作為生物界與人類密切相關的一大類生物群體，利用微生物開發(fā)利用硒資源具有廣闊的前景。含硒酵母能抑制某些腫瘤細胞的生長[3-4]，提高生物有機體的抗氧化能力[5]。Siddique等分離的細菌能還原礦山尾礦中的硒，從而改變硒的有效性[6]。Zhang等將具有硒還原能力的細菌用于廢水處理[7-8]。對于高硒地區(qū)土壤微生物，研究比較少。Burton等發(fā)現(xiàn)，硒污染地區(qū)土壤微生物具有比普通土壤微生物更強的耐受硒的能力[9]。本研究的主要內(nèi)容是分離篩選高硒環(huán)境中的微生物，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件來提高該耐硒微生物生物量，旨在為進一步對其進行開發(fā)利用創(chuàng)造良好的基礎條件。

1 材料與方法

1.1 高硒環(huán)境中微生物的分離

用取自恩施雙河富硒土壤（硒含量為36.8 μg/g）來分離細菌。細菌的分離在含有50 mg/mL的固體細菌培養(yǎng)基上進行，37 ℃培養(yǎng)12 h，選擇單菌落進行進一步研究。

1.2 菌株耐硒能力測定

將選擇的單菌落菌株分別接種到含0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg/L硒的細菌培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定D600 nm，選擇1株耐硒能力強的菌株進一步研究。

1.3 耐硒菌種的鑒定

選取1株耐硒能力強的菌種進行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、接觸酶試驗、V-P試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽試驗、吲哚試驗、菌種的耐鹽試驗等生理生化鑒定試驗。根據(jù)實驗室結(jié)果，檢索常用細菌鑒定手冊[10]，確定該耐硒菌種的種屬。

1.4 耐硒菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1 選定發(fā)酵培養(yǎng)基成分 選用葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作為碳源，濃度為10 g/L，氮源用酵母浸出物10 g/L，氯化鈉5 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0，在37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)14 h后測D600 nm。

選用酵母浸出物、胰蛋白胨和牛肉浸膏作為氮源，濃度為10 g/L，碳源用葡萄糖10 g/L，氯化鈉5 g/L，調(diào)節(jié)pH值為 7.0，在37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)14 h后測D600 nm。

1.4.2 確定碳源和氮源濃度 對選定的碳源做濃度梯度單因素試驗，濃度分別為3、7、11、15、19 g/L，氮源酵母浸出物10 g/L，氯化鈉5 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0，在37 ℃、轉(zhuǎn)速 150 r/min 條件下培養(yǎng)14 h后測D600 nm。

對選定的氮源做濃度梯度單因素試驗，濃度分別為3、7、11、15、19 g/L，碳源葡萄糖10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH值為 7.0，在37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)14 h后測D600 nm。

1.4.3 溫度和轉(zhuǎn)速單因素實驗 以碳源葡萄糖10 g/L，氮源酵母浸出物10 g/L，氯化鈉5 g/L配培養(yǎng)基，pH值7.0，接種后分別在25、30、35、40、45 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)14 h后測D600 nm。

以碳源葡萄糖10 g/L、氮源酵母浸出物10 g/L、氯化鈉 5 g/L 配培養(yǎng)基，pH值7.0，接種后分別以100、120、140、160、180、200 r/min，37 ℃培養(yǎng)14 h后測D600 nm。

1.4.4 正交試驗 根據(jù)碳源濃度、氮源濃度、溫度和轉(zhuǎn)速的單因素試驗結(jié)果進行L9（34）正交試驗，進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件。試驗因素和水平見表1，培養(yǎng)14 h后測D600 nm。

將菌株在正交試驗得出的最優(yōu)組合條件下進行培養(yǎng)，14 h 后測D600 nm，以驗證正交試驗結(jié)果。

1.5 生長曲線的測定

以碳源葡萄糖10 g/L、氮源酵母浸出物10 g/L、氯化鈉 5 g/L 配培養(yǎng)基，pH值7.0，在37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min下分別培養(yǎng)1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h后測D600 nm。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對測定結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通過Excel、SPSS軟件進行數(shù)據(jù)的誤差分析和t值檢驗，進行平行組的平均值校正和顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的耐硒能力

從圖1可見，選擇的8個菌株M3、M7、M9、M12、M13、M18、M20和M22均有一定的耐硒能力。特別是M22菌株，在硒濃度500 mg/L以下時，隨著硒濃度的增加，其D600 nm升高;且在硒濃度500 mg/L以上時，D600 nm均高于其他菌株。故本試驗選取菌種M22進行菌種鑒定和培養(yǎng)條件優(yōu)化等研究。

2.2 耐硒菌株鑒定結(jié)果

選取菌種M22進行染色和生理生化鑒定試驗，根據(jù)表2試驗結(jié)果，檢索常用細菌鑒定手冊[10]，鑒定該耐硒菌株為凝結(jié)芽孢桿菌。

2.3 耐硒菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 碳源和氮源對菌株生長的影響 如圖2所示，對于碳源的影響，葡萄糖與蔗糖無明顯差異，而它們與可溶性淀粉相比對菌體濃度增加有一定的作用，故可選葡萄糖或蔗糖來做單因素試驗。但考慮到蔗糖沒有葡萄糖好利用，且須要產(chǎn)生蔗糖酶，因此選葡萄糖來做單因素試驗。對于氮源的影響，從

胰蛋白胨、酵母浸出物到牛肉浸膏，它們依次對菌體濃度增加有明顯的作用，因此選牛肉浸膏來做單因素試驗。

2.3.2 單因素試驗結(jié)果 圖3-A為碳源濃度對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響，當葡萄糖濃度為7 g/L時，細菌的D600 nm最大，相比于3、11 g/L對D600 nm有顯著增加，故選 3、7、11 g/L 3個水平來做正交試驗。圖3-B為氮源濃度的影響，當牛肉浸膏濃度為7 g/L時，細菌的D600 nm最大，相比于3、11 g/L對D600 nm有極顯著增加，故選 3、7、11 g/L 3個水平來做正交試驗。圖3-C為溫度的影響，當溫度為30 ℃時，細菌的D600 nm最大，相比于35 ℃對D600 nm有極顯著增加，故選25、30、35 ℃ 3個水平來做正交試驗。圖3-D 為轉(zhuǎn)速的影響，當轉(zhuǎn)速為200 r/min時，細菌的D600 nm最大，故選160、180、200 r/min 3個水平來做正交試驗。

2.3.3 正交試驗 由表3可知，通過極差分析，溫度對凝結(jié)芽孢桿菌的生長影響最大，其次依次是氮源牛肉浸膏濃度、碳源葡萄糖濃度、轉(zhuǎn)速。本試驗條件下優(yōu)化水平的最佳組合為A3B3C3D1，即凝結(jié)芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖 11 g/L、牛肉浸膏11 g/L、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min。在此條件下培養(yǎng)菌株，其培養(yǎng)液D600 nm為（2.210±0.010），與第9組正交試驗相比稍低，這可能與接種的種子液的生長狀態(tài)和接種量有關。

2.4 生長曲線的測定

從圖4可知，0～1.5 h為停滯期，1.5～10 h為對數(shù)生長期，當培養(yǎng)時間達到10 h時菌體生長進入穩(wěn)定期。通過測定生長曲線，了解分離得到的凝結(jié)芽孢桿菌在不同時期的生長特征，可以根據(jù)不同的實際需要如獲得大量細菌個體、獲得細菌的初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物來選擇不同的培養(yǎng)時間。

3 討論

從恩施富硒區(qū)富硒淤泥中分離鑒定了1株耐硒凝結(jié)芽孢桿菌。在基礎研究方面，這些菌種的篩選豐富了利用微生物進行生物富硒的研究基礎，為硒資源的開發(fā)和利用提供了微生物的研究基本材料， 從而進一步對耐硒相關基因做出研究和硒代謝分子機制的研究。在應用研究方面，凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）為革蘭氏陽性桿菌，具有耐熱性好、耐受胃酸和膽汁等優(yōu)點[11-12]。芽孢桿菌類益生菌為好氧繁殖，進入人和動物腸道內(nèi)能消耗大量的游離氧，降低氧化還原電勢。對厭氧微生物乳酸菌和雙歧桿菌的生長起到促進作用，從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)的菌群平衡，提高機體免疫和抗病能力減少腸道疾病的發(fā)生;凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)繁殖的同時分泌消化酶，有助于營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，促進動物生長;其產(chǎn)生的維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸等物質(zhì)能增加小腸蠕動速度，改善腸道消化功能;產(chǎn)生抑菌物質(zhì)能對腸道不同誘因的炎癥有一定治療作用[13-18]，可以進一步研究耐硒凝結(jié)芽孢桿菌的富硒能力，開發(fā)含硒益生菌。

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