不同方法分析工礦復墾區不同植物根際微生物多樣性的比較

張變華　靳東升　郜春花　郜雅靜　李建華

摘要：以山西古交屯蘭工礦復墾區為研究對象，從不同植物種植、不同耕作制度的視角出發，將傳統分析與現代技術分析相結合，分析比較工礦復墾區植物根際微生物的多樣性，旨在為提高工礦區復墾的土壤質量提供理論依據。傳統分析結果表明，豆科植物根際微生物細菌與放線菌的數量要高于禾本科植物，毛苕子根際細菌、放線菌數量與Shannon多樣性指數均高于其他植物，在大豆—玉米—玉米輪作制度下，大豆根際細菌、放線菌數量與Shannon多樣性指數高于玉米—大豆—大豆輪作制度下玉米根際的相應指標。用16S rDNA V3～V4區操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）進行不同植物根際細菌α多樣性分析，發現自然恢復土壤的Chao1豐富度高于種植植物的土壤，與種植植物根際土壤微生物的群落結構截然不同，連種毛苕子根際與玉米—大豆—大豆輪作制度下的玉米根際土壤具有豐度較低的相似性微生物屬，大豆與苜蓿的根際微生物具有相似的親緣性。

關鍵詞：工礦復墾區;植物根際;微生物多樣性;Shannon多樣性指數

中圖分類號： S154.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0223-04

土壤微生物是維持土壤活性的重要組成部分，參與有機質分解、養分轉化和循環等多種生化過程，其多樣性是評價土壤環境質量的重要生物學指標[1]。礦區復墾土壤具有有機質含量低、團聚體少、微生物活性差的特點，然而提高礦區復墾土壤質量可以緩解我國人均耕地少、質量差的現狀，并保持農業可持續發展。根際是連接植物、土壤和微生物的紐帶，植物根系通過分泌物、脫落物與植物殘體等影響根際土壤微生物群落代謝與種群結構，進而改變根際土壤環境[2]。了解不同植被類型根際土壤的理化及微生物學特性，可以直接或間接反映植被對土壤的改良作用及植被恢復的生態效果。當前國內外的相關研究主要集中在根際與非根際土壤理化性質、土壤微生物多樣性、土壤酶活性等方面[3-5]，目前僅有少量學者在工礦區開展了不同植物根際的評價研究[6-11]，對于山西工礦復墾區不同植物根際生物學性質的相關研究較少。因此，將山西省古交屯蘭礦區復墾地作為試驗區，研究在種植不同植物的條件下根際土壤微生物多樣性特點具有重要意義，可以為土壤質量改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗區位于山西省古交屯蘭工礦復墾區，于2014年開始復墾，試驗時為復墾第4年，該區年均氣溫為9.5 ℃，平均降水量為460 mm，為溫帶大陸性氣候，鄉土作物為玉米、大豆。本試驗設置5個小區，分別為大豆—玉米—玉米輪作區、玉米—大豆—大豆輪作區、連作苜蓿區、連作毛苕子區、自然恢復區。2017年，在大豆—玉米—玉米輪作區種植大豆，在玉米—大豆—大豆輪作區種植玉米。

1.2 材料與方法

土樣采集。在2017年9月在各試驗區內選擇大小差不多的大豆15株，玉米5株;對于種植苜蓿、毛苕子與自然恢復的小區，劃定1 m×1 m區域采集樣品，設3次重復。采用抖落法[12]抖掉大塊土壤，用毛刷輕輕地將根上0～5 mm的土壤刷下作為根際土，收集在無菌塑料袋中，再放入裝有冰袋的保溫箱內，帶回實驗室立即進行化驗，不能進行及時化驗的放入 -80 ℃ 冰箱中保存。

試驗方法。（1）采用傳統微生物培養法測定土壤微生物數量，細菌培養采用牛肉膏蛋白胨培養基，放線菌培養采用高氏改良培養基，真菌培養采用孟加拉紅培養基。微生物數量以單位質量（g）干土中的菌落數表示。（2）稱取10 g根際土壤，放入滅菌的、裝有90 mL 0.85% NaCl的帶玻璃珠的三角瓶中，在旋轉式搖床上于250 r/min充分振蕩30 min，連續2次進行10倍稀釋后，在Biolog生態微板的每個孔中加入150 μL土壤接種液，放入28 ℃培養箱中培養，用Biolog分析儀每隔24 h讀取各孔的吸光度，連續測定7 d。（3）16S rDNA高通量測序，由上海派森諾生物公司對植物根際進行微生物組DNA提取、目標片段PCR擴增、產物回收純化、熒光定量等，用MiSeq測序儀測定不同植物根際微生物V3～V4區的操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）。

數據分析。用Excel、SPSS及R軟件進行方差分析與聚類分析。

2 結果與分析

2.1 傳統微生物培養結果

2.1.1 細菌培養結果 從圖1可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根際細菌數量要高于禾本科植物玉米的根際細菌數量，毛苕子根際土壤的細菌數量最多，根際土壤細菌數量排序為毛苕子>大豆>自然恢復>苜蓿>玉米。

2.1.2 放線菌培養結果 從圖2可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根際放線菌數量要高于禾本科植物玉米的根際放線菌數量，但是苜蓿、玉米、大豆與自然恢復的根際放線菌數量相差不大，根際放線菌數量排序為毛苕子>苜蓿>大 豆> 自然恢復>玉米。

2.1.3 真菌培養結果 從圖3可以看出，豆科植物苜蓿、大豆的根際真菌數量要高于禾本科植物玉米的根際真菌數量，也高于自然恢復的，連種毛苕子的根際真菌數量最少，各個條件下的真菌數量排序為大豆>苜蓿>自然恢復>玉米>毛苕子。

2.2 用Biolog生態微板分析微生物代謝功能的多樣性

2.2.1 不同植物根際微生物群落土壤微生物的平均顏色變化率（AWCD）的動態變化 AWCD表示微平板孔中顏色的平均變化率，用來描述土壤微生物的代謝活性，計算公式如下：AWCD值=[∑（C-R）]/95[13]。其中：C是所測95個反應孔的吸光度，R是對照孔的吸光度。

從圖4可以看出，不同植物根際微生物群落的AWCD值隨著培養時間的增加均呈現增長的趨勢，土壤微生物群落利用碳源的能力逐漸增強。從接種到培養24 h，各處理樣品平均吸光度無明顯變化，微生物幾乎沒有代謝碳源。在培養 24 h 后的任何時間段，毛苕子的AWCD值最高，說明其碳源利用速率高，根際土壤微生物活性較高。在培養24～48 h內，自然恢復（NR）的AWCD值要高于玉米、苜蓿，但是培養48 h后，其利用的碳源量雖然在逐漸增加，但是增長緩慢，在培養72 h后的任何時間段均低于種植其他植物的，且在培養72 h后的任何時間點，植物根際的AWCD值均表現為毛苕子>大豆>苜蓿>玉米>自然恢復。

2.2.2 不同植物根際微生物多樣性指數的差異 微生物多樣性指數表征整個生態系統中土壤微生物群落利用碳源類型的多少，即功能多樣性。表征土壤微生物代謝功能多樣性的指標為土壤微生物香農-維納指數H′、Shannon多樣性指數H、Mclntosh均一度指數U和Simpson優勢度指數D[14]，計算公式見表1。

本研究采用96 h的數據來分析計算土壤微生物多樣性指數，由表2可見，工礦區不同植物根際土壤微生物群落的優勢度指數（D）均無顯著差異，毛苕子根際土壤微生物群落Shannon指數H與均一度指數U顯著高于其他植物（P<005），且根際土壤微生物群落香農-維納指數H′也高于自然恢復與禾本科植物玉米。自然恢復的均一度指數與Shannon指數H最低，與玉米、苜蓿的香農-維納指數H′均無顯著差異，但是顯著低于輪作大豆根際土壤微生物群落的香農-維納指數H′（P<0.05），說明該礦區自然恢復的土壤微生物利用碳源的能力較差，代謝功能差，活性較低。而毛苕子根際土壤利用碳源的能力最強，活性最高。不同輪作制度下大豆與玉米相比大豆根際土壤活性較強，利用碳源能力高于玉米根際，在工礦復墾初期豆科與禾本科植物輪作與連作豆科植物對土壤微生物群落結構的影響不同。

2.2.3 16S rDNA根際細菌α多樣性分析 微生物群落α多樣性可以用多種指數來反映，本研究選用Chao1豐富度估計指數、Shannon多樣性指數。一般而言，Chao1指數越大，表明群落的豐富度越高。Shannon多樣性指數綜合考慮了群落的豐富度和均勻度。Shannon指數越高，表明群落的多樣性越高。從表3可以看出，自然恢復的根際土壤Chao1指數最大，輪作大豆根際土壤的Chao1指數最小，苜蓿根際土壤的Shannon指數最高，而輪作玉米根際土壤的Shannon指數最小。

根據樣本間的相似程度對豐度排名前50位的屬進行聚類并繪制熱圖，對高豐度和低豐度的分類單元加以區分，以顏色梯度反映樣本之間的群落組成相似度。從圖5可以看出，主要可以分為自然恢復與種植植物2類， 其中種植植物類可以分為2類，自然恢復根際土壤中豐度較高的微生物屬主要有Mycobacterium（分枝桿菌屬）、Cryobacterium（喜冷桿菌屬）、Caenimonas、Ramlibacter（沙壤土桿菌屬）、Gaiella（放線菌屬）、

Nitrobacter（硝化菌屬）、Nordella（諾德氏菌屬）。在輪作制度下，大豆與連種苜蓿相似的屬主要有Variibacter（變桿菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Ohtaekwangia、Lentzea（倫茨氏菌屬）與Gaiella（放線菌屬），但是豐度均不高;在玉米—大豆—大豆輪作制度下，玉米與連種毛苕子根際細菌群落的相似屬主要有Pseudoncardia（諾卡式菌屬）、Microvirga（微枝形桿菌屬）、Aeromicrobium（氣微菌屬）與Nonomuraea（野野村菌屬），豐度也不高。

3 結論與討論

3.1 不同方法的優點及局限性

傳統微生物培養分析法簡單、快速、易操作，適用于測定具有特殊生理功能的微生物，然而有許多微生物無法培養，難以測定[15-17];Biolog分析主要通過研究對單一碳源底物利用能力的不同來鑒定微生物群落結構，有方便快速、靈敏度高、分辨率強等優點[18]，可彌補其他方法無法獲得微生物群體活性信息的不足[19]，但是培養條件的改變可能會引起微生物對碳底物實際利用能力的改變，從而造成一定的誤差，同時目前標準數據庫中菌種資料不完善，一些種類不能被準確鑒定，只能得到相似類群[20-21];16S rDNA高通量測序法主要通過提取微生物組總DNA并進行定量，擴增，純化，測序，從而鑒定微生物菌群結構[22]，但是對于序列相同的不同細菌難以進行鑒定。

3.2 礦區不同植物根際微生物多樣性差異

植物影響土壤環境，有研究表明，不同植物根系分泌物的成分與含量不同，植物根際微生物的功能代謝有差異[23]，因此不同植物對土壤微生物群落的影響不同[24]。在本研究中，用傳統培養法得到的結果表明，該工礦復墾區不同植物根際微生物數量不同，豆科植物根際微生物細菌、放線菌數量要多于禾本科植物，這可能與豆科植物本身具有較強的固氮能力相關。Biolog技術分析表明，不同植物根際微生物利用碳源能力存在差異性，自然恢復可利用碳源的微生物活性最低，代謝功能最差，可能與復墾初期自然恢復土壤有機質含量低有關，而毛苕子根際微生物活性最高。16S rDNA分析表明，自然恢復根際微生物與種植植物根際微生物差異大，且微生物豐度最高，但是多樣性指數低于豆科植物，高于禾本科植物。

3.3 將來的研究方向

本研究區處于工礦復墾初期，礦區生態環境恢復與耕地面積的增加是當地農業可持續發展的關鍵，在民生福祉的建設中意義重大，因此，需要多種方法與技術相結合并進行長期監測以關注礦區土壤質量的變化，為礦區生態建設提供理論依據。

參考文獻：

[1]楊海君，肖啟明，劉安元. 土壤微生物多樣性及其作用研究進展[J]. 南華大學學報（自然科學版），2005，19（4）：21-26，31.

[2]陸雅海，張福鎖. 根際微生物研究進展[J]. 土壤，2006，38（2）：113-121.

[3]安韶山，李國輝，陳利頂. 寧南山區典型植物根際與非根際土壤微生物功能多樣性[J]. 生態學報，2011，31（18）：5225-5234.

[4]孟令軍，耿增超，殷金巖，等. 秦嶺太白山區6種中草藥根際與非根際土壤化學性質及酶活性[J]. 應用生態學報，2012，23（10）：2685-2692.

[5]Adriaensen K，van der Lelie D，van Laere A，et al. A zinc-adapted fungus protects pines from Zinc stress[J]. New Phytologist，2004，161（2）：549-555.

[6]滕 應，黃昌勇，龍 健，等. 復墾紅壤中牧草根際微生物群落功能多樣性[J]. 中國環境科學，2003（3）：72-76.

[7]高 婷. 礦區與非礦區艾蒿根部微生物數量比較研究[J]. 廣東農業科學，2009（5）：155-157.

[8]湛方棟，何永美，李 元，等. 云南會澤廢棄鉛鋅礦區和非礦區三種野生植物根際微生物研究[J]. 土壤通報，2010（2）：337-341.

[9]楊期和，劉惠娜，李清華，等. 粵東鉛鋅尾礦區3種優勢植物根際土壤微生物的活性研究[J]. 中國農學通報，2012，28（30）：56-64.

[10]王 義，李少朋，陳 鑄，等. 叢枝菌根真菌對采煤塌陷地玉米生長的影響[J]. 安徽農業科學，2013（30）：12113-12115.

[11]侯 穎. 采煤塌陷復墾初期土壤微生物及根際效應研究[J]. 廣東農業科學，2013，40（15）：72-75.

[12]Riley D，Barber S A. Bicarbonate accumulation and pH changes at the soybean root-soil interface[J]. Soil Science Society of America Journal，1969，33（6）：905-908.

[13]Garland J L，Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization[J]. Applied and Environmental Microbiology，1991，57（8）：2351-2359.

[14]時 鵬，高 強，王淑平，等. 玉米連作及其施肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態學報，2010，30（22）：6173-6182.

[15]蔡燕飛，廖宗文. 土壤微生物生態學研究方法進展[J]. 土壤與環境，2002，11（2）：167-171.

[16]Louise M D，Gwyn S G，John H，et al. Management influences no soil microbial communities and their function in botanically diverse hay meadows of northern England and Wales[J]. Soil Biology and Biochemistry，2000，32（2）：253-263.

[17]Zq H，Wei Z Y，Qin P. Contamination character analysis of filling reclaimed soil with fly ash in subsided land[J]. China Environmental Science，2004，24（3）：311-315.

[18]鄭 華，歐陽志云，方治國，等. BIOLOG在土壤微生物群落功能多樣性研究中的應用[J]. 土壤學報，2004，41（3）：456-461.

[19]Garland J L，Lehman R M. Dilution/extinction of community phenotypic characters to estimate relative structural diversity in mixed communities[J]. FEMS Microbiology Ecology，1999，30（4）：333-343.

[20]Medeiros P M，Fernandes M F，Dick R P. Seasonal variations in sugar contents and microbial community in a ryegrass soil[J]. Chemosphere，2006，65（5）：832-839.

[21]鐘文輝，蔡祖聰. 土壤微生物多樣性研究方法[J]. 應用生態學報，2004，15（5）：899-904.

[22]劉國華，葉正芳，吳為中. 土壤微生物群落多樣性解析法：從培養到非培養[J]. 生態學報，2012，32（14）：4421-4433.

[23]Nayyar A，Hamel C，Lafond G，et al. Soil microbial quality associated with yield reduction in continuous-pea[J]. Applied Soil Ecology，2009，43（1）：115-121.

[24]Harch B D，Correll R L，Meech W，et al. Using the Gini coefficient with BIOLOG substrate utilisation data to provide an alternative quantitative measure for comparing bacterial soil communities[J]. Journal of Microbiological Methods，1997，30（1）：91-101.陳 雅，尹昭森，王文嘉，等. 混凝-過氧化氫氧化聯用預處理微藻液化廢水的研究[J]. 江蘇農業科學，2019，47（4）：227-232.