綠原酸包埋工藝優化及其包埋物腸胃緩釋性

劉沙彥　彭曙光　羅井清　周志成　王征

摘要：為提高綠原酸的生物利用度，采用多孔淀粉對綠原酸進行包埋，再用卵磷脂對綠原酸-多孔淀粉包埋物進行包裹，形成復合包埋物。通過單因素和正交試驗對其吸附綠原酸的條件進行優化，得到最佳包埋條件：芯壁比為 1 ∶ 10，pH值為3，溫度為30 ℃，時間為2.0 h，包埋效率達到82.5%，包埋量為82.4 mg/g。通過攪拌將卵磷脂和綠原酸-多孔淀粉包埋物混合形成卵磷脂復合包埋物，其包埋效率仍為82.5%。分別利用傅里葉紅外、掃描電鏡和紫外掃描對包埋物進行了分析和確證。將2種包埋物分別于人工模擬胃液和腸液環境中進行綠原酸釋放研究，結果顯示卵磷脂復合包埋物在人工模擬胃液中的最高釋放率為16.3%，在人工模擬腸液中的最高釋放率為59.2%，而綠原酸-多孔淀粉包埋物在上述2種環境下的釋放率分別為64.3%和35.2%。表明卵磷脂復合物能更好地經受胃液環境，到達腸液中釋放綠原酸，也表明該包埋工藝可以提高綠原酸的生物利用度。

關鍵詞：綠原酸;包埋;多孔淀粉;卵磷脂;緩釋性

中圖分類號：S188? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0171-05

綠原酸（chlorogenic acid）是一種植物體在有氧呼吸過程中合成的苯丙素類物質，是由咖啡酸和奎尼酸縮合而成的，綠原酸的分布廣泛，在食物和中藥材中，如杜仲、金銀花和咖啡豆等均含有綠原酸。綠原酸具有多種功效，其中包括抗菌消炎、抗病毒、清除自由基、降糖、降脂和保肝利膽等[1-2]。彭冰潔等研究發現，用綠原酸飼喂SD大鼠，能夠顯著減緩高脂飼喂的SD鼠質量的增加，并通過調節PI3K/Akt途徑、AMPK途徑和胰島素敏感性，改善骨骼肌中糖代謝[3]。此外，高純度的綠原酸也被廣泛應用于保健產品、片劑、膠囊藥品和中藥注射藥品等。但由于綠原酸本身性質不夠穩定，在陽光照射、高溫、潮濕、強酸堿等條件下極易發生氧化反應從而失去活性[4]，這使得綠原酸的生物利用度受到了限制。因此，實現綠原酸包埋后的可控釋放是提高綠原酸生物利用度的有效途徑之一。

多孔淀粉（porous starch），又名微孔淀粉，是一種新型變性淀粉，是指具有生淀粉酶活力的酶，在低于淀粉糊化溫度下作用于生淀粉后形成的產物[5]。多孔淀粉在本質上仍是淀粉，應與原淀粉有類似的性能，但與之相比，最明顯的區別在于多孔淀粉具有十分強大的吸附能力，多孔淀粉具有一種特殊的中空的空間結構，有大量的糖環羥基存在于這些結構表面，這些羥基是氫原子供體，可以與綠原酸上氧原子形成牢固的氫鍵，綠原酸上的氫原子具有酸性，電子云密度低，所以也是氫供體，而糖環分子的橋頭氧原子，電負性較低，電子云密度高，可以與綠原酸中的氫原子形成牢固的氫鍵，如此便形成了一個穩定的六元環效應，從而使得多孔淀粉對綠原酸有良好的吸附作用[6]。

卵磷脂（lecithin）是人體組織中含量最高的磷脂，是構成神經組織的重要成分，屬于高級神經營養素[7]，又稱為蛋黃素，被譽為與蛋白質、維生素并列的“第三營養素”，因其無毒無害，且具有良好的附著性而被廣泛應用于食品以及醫藥研究領域[8]。

盧曉霆等曾利用多孔淀粉、海藻酸鈉和殼聚糖制備綠原酸微膠囊，在一定程度上提高了穩定性[9]。本試驗擬用多孔淀粉對綠原酸進行包埋吸附，最后再用卵磷脂對綠原酸-多孔淀粉包埋物進行進一步的包裹，形成性質更加穩定的綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂復合包埋物，得到的包埋物包埋率較高且制備工藝較簡單實用，可為有效應用綠原酸提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 綠原酸普通品（純度98%），購自源葉生物有限公司（上海）;多孔淀粉，購自龍詠生物科技有限公司（長沙）;磷酸二氫鉀，購自西隴化工股份有限公司;胃蛋白酶（10 000 NFU/mg）、胰蛋白酶（250 NFU/mg），購自合肥博美生物科技有限責任公司;其他試劑如卵磷脂、鹽酸和氫氧化鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 人工模擬胃腸液的配制[10] 人工模擬胃液：取9 mL濃HCl，加水約800 mL及胃蛋白酶10 g，充分溶解后，調節pH值至1.3，定容至1 000 mL，即為人工模擬胃液。

人工模擬腸液：稱取6.8 g KH2PO4溶于約500 mL水中，另稱取10 g胰蛋白酶加水溶解，定容至1 000 mL，用NaOH調pH值至7.6，即為人工模擬腸液。

1.2 儀器

ZWM-uT1-10型超純水機，湖南中沃水務環?？萍加邢薰?PL303型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司（上海）;DTJ-2磁力攪拌器，鼎泰恒盛生化科技設備制造有限公司;SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵，邦西儀器科技有限公司（上海）;Lab-1A-50E型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司;UV1802G型紫外分光光度計，天津冠澤科技有限公司;1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司（美國）;S-3700掃描電子顯微鏡（日本日立公司）;VECTOR-22型傅里葉紅外光譜儀（德國布魯克公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制作 精確稱取10 mg綠原酸標準品，用超純水定容至100 mL容量瓶中，即制成100 μg/mL綠原酸標液。分別吸取原液33.3、20.0、16.7、10.0、8.3、6.7 mL定容至100 mL，配制成以下濃度的綠原酸標準液：3、5、6、10、12、15 μg/mL，空白為超純水。利用紫外-可見分光光度計在327 nm波長處測定綠原酸濃度和對應的吸光度[11]。

精確稱取20 mg綠原酸標準品，在超聲條件下溶解于95%甲醇中，定容至50 mL，制成濃度為400 μg/mL的綠原酸標液。分別吸取原液0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 mL定容至 10 mL，配制成以下濃度的綠原酸標準液：20、60、100、140、200 μg/mL，經0.45 μm濾膜過濾后進行高效液相色譜法（HPLC）檢測。

1.3.2 包埋物的制備

1.3.2.1 多孔淀粉-綠原酸包埋物的制備 精確稱取定量的綠原酸溶于一定pH值的緩沖液中，超聲波控溫處理作用于綠原酸15 min后，加入不同質量的多孔淀粉，設置不同溫度、時間，在電磁攪拌器上勻速攪拌下作用一段時間;攪拌反應后將混合液抽濾，得到過濾物，在冷凍干燥機中干燥即得到多孔淀 粉- 綠原酸包埋物的樣品。

1.3.2.2 綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋物的制備 取多孔淀粉-綠原酸包埋物樣品溶解于10 mL一定pH值的緩沖液中，再取250 mg卵磷脂，溶解于10 mL乙醇溶液中，超聲混勻后，將其緩慢加入多孔淀粉-綠原酸溶液中，低速反應一定時間后，在50 ℃條件下用旋轉蒸發儀除去乙醇溶液，將濃縮后的樣品處理后冷凍干燥，即得到綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂復合包埋物。

1.3.3 包埋效率的測定 先將冷凍干燥得到的樣品取出，稱質量后，將其置于燒杯中，先加乙醇溶液溶解卵磷脂，靜置 15～20 min后，抽濾除去乙醇和卵磷脂，隨后取多孔淀粉-綠原酸包埋物溶解到50 mL超純水中，置于電磁攪拌機上，于高轉速、高溫條件（600 r/min以上，50 ℃）下反應2 h后，取樣，稀釋100倍左右，于紫外分光光度計下波長327 nm處檢測樣品吸光度，并根據標準曲線計算其綠原酸濃度，再根據公式計算出包埋效率。

1.3.4 單因素試驗對包埋條件的優化

1.3.4.1 包埋效率和包埋量的定義 包埋效率是指包埋進去的綠原酸量與總共投入的綠原酸量的比值，計算公式為：包埋效率=（包埋進去的綠原酸量/投入綠原酸總量）×100%。其中，包埋量是指單位壁材中包埋進去的綠原酸量;此處包埋進去的綠原酸含量為包埋物釋放出來的綠原酸量的最大值，即在高轉速高溫條件下釋放2 h時達到的最大釋放值。

1.3.4.2 芯壁比對包埋效率的影響 分別以芯壁比（芯材為綠原酸，壁材為多孔淀粉，芯材與壁材的質量比即為芯壁比）為1 ∶ 20、1 ∶ 10、3 ∶ 20、1 ∶ 5，1 ∶ 4，3 ∶ 10反應，pH值為4，溫度為35 ℃，時間為2 h，轉速為200 r/min，測定包埋效率與包埋量。

1.3.4.3 pH值對包埋效率的影響 調節反應的pH值分別為2、3、4、5、6，芯壁比為1 ∶ 10，溫度為35 ℃，時間為2 h，轉速為200 r/min，測定包埋效率。

1.3.4.4 溫度對包埋效率的影響 分別調節電磁攪拌器的溫度為30、35、40、45、50 ℃，使其反應，芯壁比為1 ∶ 10。pH值為4，時間為2 h，轉速為200 r/min，測定包埋效率。

1.3.4.5 時間對包埋吸附率的影響 分別調節電磁攪拌器的反應時間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，使其反應，芯壁比為2 ∶ 20，pH值為4，溫度為35 ℃，轉速為200 r/min，測定包埋效率。

1.3.5 正交試驗法確定最佳包埋組合條件 在單因素試驗的基礎上，確定了芯壁比、pH值、溫度、時間都是對包埋效率有較大影響的因素，根據單因素試驗結果，設計了正交試驗，即以芯壁比、pH值、溫度、時間為自變量，包埋反應的包埋效率為因變量，作4因素3水平的正交試驗L9（34），正交試驗設計見表1。

1.3.6 包埋物結構研究

1.3.6.1 掃描電鏡檢測 分別取適量綠原酸、多孔淀粉、綠原酸和多孔淀粉的物理混合物、綠原酸-多孔淀粉包埋物和綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋復合物均勻涂抹在膠帶上，在真空狀態下的噴金儀中噴金30 s后，這樣的樣品會有1層金薄膜層，然后在掃描電鏡中觀察樣品形狀。

1.3.6.2 紅外光譜檢測 分別取適量的綠原酸、多孔淀粉、綠原酸與多孔淀粉的物理混合物、綠原酸-多孔淀粉包埋物和綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋復合物樣品，用KBr壓片，掃描波數為600～4 000 cm-1，進行紅外線（IR）掃描和分析。

1.3.7 2種包埋物體外模擬腸液和胃液環境緩釋性的研究 取最優條件下制備的綠原酸-多孔淀粉包埋物和綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂復合包埋物，分別加入一定量的模擬胃液和模擬腸液，置于搖床下，在37 ℃、150 r/min的條件下分別反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后，取定量樣液稀釋一定倍數后在紫外分光光度計下于327 nm處檢測綠原酸的濃度（根據待測樣液的澄清程度決定是否過濾）。

2 結果與分析

2.1 4種因素對包埋效率和包埋量的影響

在包埋過程中，芯材用量如果較少，包埋效率會更好，但單位壁材的包埋量會較低。所以本研究中筆者用包埋量和包埋效率來判斷芯壁比對包埋效果的影響，這里取兩者的乘積。如圖1-A所示，可以很明顯地發現，在兩者的交點處，包埋效率和包埋量的乘積為最高值，因此選擇最佳包埋芯壁比為 2 ∶ 20，后續正交試驗芯壁比梯度選取3個最佳芯壁比梯度，即1 ∶ 20、1 ∶ 10、1 ∶ 5。由圖1-B可知，包埋效率先增高后降低，在pH值為4時達到最高值，后續正交試驗pH值梯度選取3個最佳pH值梯度，即3、4、5。由圖1-C可知，隨著溫度升高，包埋效率先增高后降低，在35 ℃時達到最高值，因此確定包埋最佳溫度為35 ℃，后續正交試驗溫度梯度選取3個最佳溫度梯度，即30、35、40 ℃。由圖1-D可知，隨著時間的增長，包埋效率先增高后降低，在時間為1.5 h時達到最高值，因此確定包埋最佳時間為1.5 h，后續正交試驗的pH值梯度選取3個最佳時間梯度，即1.0、1.5、2.0 h。

2.2 正交試驗法對綠原酸包埋工藝條件的優化結果

由表2可知，在正交試驗中，4種對綠原酸包埋率影響的因素中，其影響程度的大小為A>B>D>C，即芯壁比>pH值>時間>溫度。最優的組合水平為A2B1C1D3，即芯壁比為1 ∶ 10，pH值為3，溫度為30 ℃，時間為2.0 h;通過驗證試驗得出此條件下包埋效率可達82.5%，包埋量為41.2 mg，即單位質量淀粉對綠原酸的包埋量為82.4 mg/g，包埋效率和包埋量的乘積為33.99，高于各正交試驗組（最高為33.2）即當包埋的條件為芯壁比為1 ∶ 10、pH值為3、溫度為30 ℃、時間為2.0 h時，包埋效果最好。

2.3 掃描電鏡結果及分析

由圖2-A可以看出，綠原酸單體是個體單獨存在的，形狀為片狀、塊狀或條狀。由圖2-B可以看出，多孔淀粉單體是類似球體的形狀，而且球體表面有大量的多孔結構，且多孔不僅僅是在淀粉表面，在多孔的內部也有孔隙，這樣的疏松多孔結構，使得比表面積很大，從而使得多孔淀粉具有很強的吸附能力。由圖2-C可以看出，多孔淀粉和綠原酸的物理混合物中既有條狀和塊狀的綠原酸，又有類似球狀且布滿孔洞的多孔淀粉，說明兩者并未反應，只是簡單的物理混合。由圖2-D可以看出，綠原酸-多孔淀粉包埋物中球狀多孔淀粉的孔洞少了很多，而且許多孔洞明顯變淺了，孔洞里面被綠原酸填充，而且多孔淀粉外表面幾乎沒有綠原酸，證明綠原酸在多孔淀粉孔洞的吸附作用下被包埋進去。由圖2-E可以看出，綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋復合物中大部分球狀多孔淀粉外部被包裹了1層光滑的油狀物質，即卵磷脂，然而還是有少量多孔淀粉外部沒有完全被卵磷脂包裹住，仍然有孔洞結構存在。說明卵磷脂成功將綠原酸-多孔淀粉包埋物進行了進一步的包裹，從而形成了綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋復合物。

2.4 紅外光譜結果及分析

由圖3可知，綠原酸具有酚羥基（3 169 cm-1）、苯環（1 451、1 528、1 598 cm-1）、羰基（1 693 cm-1）的特征吸收峰;多孔淀粉在3 000～3 500 cm-1處出現羥基的伸縮振動峰，在 930～1 150 cm-1處出現非對稱的C—O—C伸縮振動特征峰;綠原酸-多孔淀粉包埋物中，雖然保留了多孔淀粉的大部分吸收峰，但綠原酸在500 cm-1到1 750 cm-1之間的大部分特征吸收峰消失了，表明綠原酸與多孔淀粉發生了相互作用，但包埋物在掃描范圍內是沒有出現新的吸收峰的，說明包埋物的形成并沒有生成新的共價鍵，綠原酸與多孔淀粉保留了各自的化學結構;卵磷脂包埋物也保留了綠原酸-多孔淀粉包埋物的部分吸收峰，但在1 800 cm-1以上的區域發生明顯變化，說明卵磷脂包埋物是將綠原酸-多孔淀粉包埋物進一步包裹，從而形成綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋物復合物。

2.5 2種包埋物體外模擬腸液和胃液環境緩釋性的研究結果

由圖4可知，多孔淀粉包埋物在胃液環境中的綠原酸釋放效率最高，為64.3%，而加了卵磷脂的包埋復合物在胃液環境下的釋放率最高僅有16.3%，說明卵磷脂的添加很好地保護了在胃液環境下的包埋物中的綠原酸，使綠原酸在胃液環境下釋放率明顯降低。

由圖5可知，卵磷脂復合包埋物在腸液環境中的釋放率（最高為59.2%）遠遠高于卵磷脂復合包埋物在胃液中的釋放率（最高僅有16.3%），而且也高于多孔淀粉包埋物在腸道中的釋放率35.2%。說明卵磷脂的添加很好地保護了在胃液環境中的包埋物，減少了綠原酸在胃液中的釋放，能夠更好地到達腸液中進行釋放。

3 討論與結論

綠原酸藥理活性強，在植物界中廣泛存在，但綠原酸本身性質不夠穩定，易被氧化失活。近年來，隨著科技的進步，對綠原酸進行包埋來保護其穩定性的研究已經有很多有意義的結果[12-13]，進而較大地提高了綠原酸的生物利用度。本研究通過對綠原酸包埋工藝的優化和模擬包埋物體外緩釋性的研究，得到的綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂復合包埋物具有較好的包埋效果，包埋效率為82.5%，腸胃釋放效果穩定。

優化單因素試驗結果顯示，隨著芯壁比的增大，包埋效率呈現降低的趨勢，而包埋量則是隨芯壁比的增大而增大，但是當芯壁比為1 ∶ 5時，再增加芯材的投入，包埋量也不會增加，證明此時壁材吸附量已經達到飽和，根據扈瑞瑞等的方法[11]，以包埋效率和包埋量2個指標來判斷包埋效果，因此本試驗的包埋效果也由包埋量和包埋效率兩者的綜合值來判斷，這里取兩者的乘積即圖中交點處為乘積最高值。當pH值過低時，多孔淀粉的結構容易被破壞而導致包埋效率降低;然而在pH值過高時，綠原酸不穩定，溶解度也會降低，從而使多孔淀粉對綠原酸的吸附效果降低，導致包埋效率下降，由本研究結果可知，pH值為4時最合適的;根據駱慧敏的研究，多孔淀粉吸附綠原酸是一個放熱的過程，因此體系反應溫度不能過高，為維系整個反應體系一定的分子動能，需要維持一定的溫度以保證反應的活化能[6]，由本研究結果可知，在 35 ℃ 時效果最好。在時間因素中多孔淀粉吸附時間進程中，時間如果過長將會導致多孔淀粉懸浮液聚集在一起從而使得釋放綠原酸受阻，影響包埋效果。由本研究結果可知，在 1.5 h 時包埋效果最佳;吳培龍等研究探討了多孔淀粉作為載體吸附茶多酚的性能，最大吸附量為68.65 mg/g[14]，本試驗的包埋量為82.4 mg/g，包埋效果理想。

由于多孔淀粉是淀粉結構，在胃酸的強酸條件下容易被分解[5]，從而導致大量綠原酸被釋放出來，而加了卵磷脂的包埋復合物在胃液環境下的釋放率明顯降低，由本研究結果可知，最高僅有16.3%，說明卵磷脂的添加很好地保護了在胃液環境中的包埋物，從而使得綠原酸釋放得很少，因此在胃液環境中綠原酸-多孔淀粉包埋物的釋放率高于綠原酸-多孔淀 粉- 卵磷脂包埋物。卵磷脂屬于脂溶性物質，該類物質在胃液的強酸環境條件下比較穩定，不會被水解，相反，在腸液的中性和弱堿性環境條件下會被水解。耿升等用卵磷脂包埋綠原酸，得到綠原酸-卵磷脂復合物，能達到較高的包埋量，并極大地提高綠原酸的脂溶性[15]。本試驗為了保證綠原酸能穩定地通過胃液環境，到達腸液環境，并在腸道穩定地緩釋，采用了復合包埋。結果也證明，綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂復合包埋物能夠在腸胃環境下達到較好可控釋放的效果。但是，在體外模擬腸胃環境釋放試驗中，無論在胃液還是在腸液環境中，綠原酸并沒有完全被釋放出來。其在體內的試驗效果，需要深入研究。

本研究通過對綠原酸包埋工藝的優化和模擬包埋物體外緩釋性的研究，得到的綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂復合包埋物具有較好的包埋效果（包埋效率為82.5%）和較穩定的腸胃釋放效果。通過掃描電鏡和紅外光譜檢測都表明，綠原酸被多孔淀粉成功吸附包埋進去，卵磷脂也成功地將綠原酸-多孔淀粉包埋物包裹，形成的綠原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋物為復合包埋物，具有比單層包埋物更好的穩定性和腸胃環境的緩釋性，此外其制備工藝簡單、廉價、環保安全，能夠很好地提高綠原酸生物利用度，為更好地應用于食品和醫藥保健領域提供參考依據。

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