辣椒堿的提取優(yōu)化及對儲糧害蟲的防治效果

陳謙　傅舒　高鵬　楊敏　劉綿學　吳琴　鄭宇　潘平川　黃敏

摘要：利用超聲-溶劑法提取辣椒中的辣椒堿，采用Plackett-Burman設計對影響辣椒堿提取率的7個因素進行評價，篩選出具有顯著效應的3個因素：乙醇濃度、顆粒大小、提取溫度，通過Box-Behnken試驗研究各因素及其交互作用對響應值的影響。結果表明，最優(yōu)提取工藝參數(shù)是乙醇濃度為60%，顆粒大小為80目，溫度為41.8 ℃，提取次數(shù)為3次，超聲功率為120 W，料液比為1 g ∶ 6 mL，提取時間為10 min，在此條件下，辣椒堿提取率為（54.08±0.74） mg/g，與模型預測值相符。另外，辣椒堿濃度大于8.0 mg/mL時，對赤擬谷盜和谷蠹均有較好的驅避效果，而糙米中的辣椒堿濃度為1.0 mg/g時，對這2種害蟲的拒食作用顯著，辣椒堿處理組的糧食損失量僅為對照的43.17%（赤擬谷盜）、41.59%（谷蠹）。

關鍵詞：辣椒堿;響應面法;儲糧害蟲;驅避作用;拒食作用

中圖分類號： S482.3+9? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0157-05

糧食安全是關系國計民生的重大戰(zhàn)略問題，目前我國耕地不斷減少，人口逐漸增加，糧食單產(chǎn)提高幅度有限。而根據(jù)國家糧食豐產(chǎn)工程項目組調(diào)研結論，我國每年儲糧損失率約為5%～10%，若按8%來計算，每年僅儲糧損失就達240億kg[1]，因而降低糧食產(chǎn)后儲藏損失是減輕國內(nèi)糧食供需矛盾、保障糧食安全的重要手段。長期以來，國內(nèi)外主要利用化學殺蟲劑，如磷化氫熏蒸法來殺滅儲糧害蟲，造成糧食中有毒有害物質(zhì)殘留、環(huán)境污染、害蟲產(chǎn)生抗性以及用藥量不斷增加等后果[1-2]。因此，迫切須要開發(fā)一種高效、安全、環(huán)境相容性優(yōu)良的儲糧害蟲防治技術。

植物源殺蟲劑（plant-based insecticides）具有選擇性強、作用機制復雜、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境友好、安全性高等突出優(yōu)點，是開發(fā)綠色儲糧殺蟲劑的重要來源[3]。香草酰胺類生物堿成分是辣椒辛辣味的主要來源，主要由辣椒素（capsaicin）、二氫辣椒素（dihydrocapsaicin）和降二氫辣椒素（nordihydrocapsaicin）等3種類似物組成，三者占辣椒總堿含量的95%以上。辣椒堿具有多種生物活性和生理功效，目前被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、軍事等領域，是一種天然、安全、環(huán)境友好的化合物[4]。Madhumathy等的研究證明，辣椒堿對致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）和斯氏按蚊（Anopheles stephensi）的幼蟲有良好的殺滅作用[5];劉新等的研究表明，辣椒堿對桃蚜[Myzus persicae （Sulzer）]具有良好的防治效果[6];陳學文通過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對枸杞蚜蟲（Aphis sp.）的殺滅作用顯著，其致死中濃度（lethal concentration 50，簡稱LC50）為13.21 mg/L[7];鄒華嬌的田間試驗結果表明，9%的辣椒堿微乳劑對菜青蟲[Pieris rapae（L.）]和菜蚜（Lipaphis erysimi）有較好的防治效果[8];Saah等通過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿可使泰國香米中米象（Sitophilus oryzae）數(shù)量從（137.0±4.08）個/100 g降低到（3.67±0.82）個/100 g，同時也可明顯降低米中總菌落數(shù)和霉菌數(shù)[9];尉洪超等的研究表明，含辣椒堿的聚乙烯（polyethylene，簡稱PE）防蟲薄膜對赤擬谷盜（Tribolium castaneum）在80 h觸殺死亡率可達90%以上[10];還有研究表明，2%辣椒堿對書虱（booklice）的防治效果優(yōu)于幾種化學驅蟲劑[11]。因此，辣椒堿在防治儲糧害蟲中具有較大的應用潛力。

超聲輔助提取技術具有提取時間短、提取效率高、適用性廣等優(yōu)點，廣泛應用于天然產(chǎn)物的提取中[12-14]。而響應面法（response surface methodology，簡稱RSM）可以有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳工藝條件，是一種應用廣泛的試驗優(yōu)化方法[15-17]。本試驗首先對辣椒堿超聲-溶劑法提取條件進行研究與優(yōu)化，并分析辣椒堿對3種儲糧害蟲-玉米象（Sitophilus zeamais）、赤擬谷盜（T. castaneum）和谷蠹（Rhizopertha dominica）的趨避和拒食作用，為開發(fā)綠色、高效的儲糧害蟲防治技術提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試害蟲為谷蠹、赤擬谷盜、玉米象，來源于中儲糧成都糧食儲藏科學研究所;大紅袍干辣椒購買于本地大型超市，50 ℃ 平衡水分4 h后利用粉碎機粉碎，過分樣篩后避光保存?zhèn)溆?合成辣椒堿（nonivamide），購自于浙江杭州瑞樹生化有限公司，HPLC級（可在高效液相色譜中使用的試劑的純度），純度為95.84%;中速定性濾紙，購自于浙江杭州特種紙業(yè)有限公司;廣口塑料瓶，容量為240 mL，口徑為60 mm，底部直徑×高度為70 mm×90 mm;所用試劑均為分析純，購自于四川成都科龍化工有限公司。

1.2 主要儀器與設備

分析天平，精度為0.1 mg，MS104S，購自于瑞士Mettler Toledo公司;紫外分光光度計，UV-1700（E），購自于日本島津公司;電熱鼓風干燥箱，TH-02-260B，購自于四川成都易華天宇試驗設備有限責任公司;人工氣候箱，PQX-330B-22H，購自于浙江寧波萊福科技有限公司;超純水機，艾科浦AFZ-1002-U，購自于重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司;小型粉碎機，JYL-C025，購自于九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試害蟲的飼養(yǎng) 谷蠹、赤擬谷盜、玉米象培養(yǎng)方法參考歐陽建勛等的方法[2]，在室內(nèi)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設為（26.0±0.5） ℃，相對濕度為65%，試驗時間為2017年的4—6月。

1.3.2 辣椒堿的提取 取過篩后的0.500 0 g辣椒粉，加入一定體積、一定濃度的乙醇，超聲處理后，4 000 r/min離心 5 min，取上清液混合后定容于25 mL容量瓶中待測。

1.3.3 辣椒堿提取率的測定 上清液中辣椒堿含量的測定按照GB 28314—2012《食品添加劑 辣椒油 樹脂》中方法2的描述進行測定，然后再換算成相應的辣椒堿提取率[18]：

辣椒堿提取率（mg/g干樣）=[辣椒堿含量（%）×提取液體積（mL）×1 000]/[100×辣椒質(zhì)量（g）]。

1.3.4 提取條件優(yōu)化

1.3.4.1 Plackett-Burman（PB）設計 影響辣椒堿提取效果的可能因素有料液比、乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間、超聲功率、處理溫度、顆粒大小等。利用Design Expert 10.0.7軟件進行PB試驗設計，選用試驗次數(shù)N=12的設計組合對這7個因素進行分析，另設置4個虛擬變量用于估計誤差，響應值為辣椒堿的提取率（mg/g）。每個因素設置高低2個水平（表1）。試驗設計和結果見表2，所有試驗重復3次，取平均值。

9.18

1.3.4.2 最陡爬坡試驗 響應面法優(yōu)化必須在最優(yōu)點的附近區(qū)域模擬真實情形，為獲得最佳提取條件范圍，可采用最陡爬坡試驗對影響結果顯著因素進行逼近。根據(jù)PB試驗結果，選擇對辣椒堿提取率有顯著效應的因素，根據(jù)這些因素效應大小及變化方向進行最陡爬坡試驗，由此接近最大響應值的區(qū)域，所有試驗重復3次，結果以平均值±標準誤表示。

1.3.4.3 Box-Behnken design（BBD）優(yōu)化提取條件 根據(jù)最陡爬坡試驗結果，利用BBD試驗設計，建立3因素3水平數(shù)學模型對辣椒堿的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，試驗的因素水平如表3所示，試驗設計和數(shù)據(jù)分析在Design Expert 10.0.7中進行。

1.3.5 辣椒堿對供試害蟲的驅避作用

1.3.5.1 辣椒堿-乙醇溶液的配制 準確稱取10.416 7 g的95.84%辣椒堿標品，溶于少量無水乙醇，再定容至100 mL，配制成10%的辣椒堿-乙醇儲備液。其他濃度的辣椒堿-乙醇溶液則通過儲備液稀釋配制。

1.3.5.2 驅避試驗 驅避試驗方法參考文獻[1，19]進行，略有改進的地方有：將直徑為7 cm的圓形定性濾紙裁成兩半，一半濾紙均勻滴加0.2 mL辣椒堿溶液，另一半滴加等量無水乙醇作對照，在室溫下靜置使乙醇完全揮發(fā)，然后用雙面膠濾紙重新拼接并固定于培養(yǎng)皿內(nèi)，接入3種害蟲，每個處理各20頭，避光放入人工氣候箱中，溫度為（26.0±0.5） ℃，相對濕度為（75±5）%，每個處理設3個重復，接蟲后于1、6、12、24、48、72、96 h檢查成蟲分布，取平均值計算驅避率。驅避效果評價方法如表4所示[1]。

驅避率=（對照紙上害蟲數(shù)量-處理紙上害蟲數(shù)量）/對照紙上害蟲數(shù)量×100%。

1.3.6 辣椒堿對供試害蟲的拒食作用 拒食試驗方法參考文獻[1，19]進行，略有改進的地方有：將糙米與辣椒堿儲備液均勻混合，使糙米中辣椒堿含量為0.5、1.0、2.0 mg/g，在室溫下?lián)]發(fā)乙醇。稱取15.0 g糙米裝入廣口塑料瓶中，接入20頭害蟲，同時設置等量乙醇處理的對照組，放入人工氣候箱，溫度為（26.0±0.5） ℃，相對濕度為（75±5）%，每個處理設3個重復。每隔3 d清理1次幼蟲，每隔7 d分離害蟲和糙米，計算糧食損失質(zhì)量，取平均值為試驗結果，進行為期 35 d 的跟蹤試驗。利用PASW Statistics 18軟件對結果進行ANOVA分析，采用Duncans多重比較法分析結果之間的差異，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計

采用PB試驗設計可以快速有效地篩選出影響辣椒堿提取率的關鍵因素，方便進一步研究。利用Design Expert 1007軟件對PB結果進行回歸分析，如表5所示。

由表5可知，此回歸模型的主效應P值為0.019 7，表明PB試驗設計因素在所選取的水平范圍內(nèi)對辣椒堿提取率的作用顯著，同時決定系數(shù)為0.999 9，調(diào)整決定系數(shù)為 0.999 3，說明回歸模型設計可靠。另外，由表5還可知，對辣椒堿提取率有顯著影響的前4位因素有顆粒大小、乙醇濃度、提取次數(shù)、提取溫度，其相關性可用方程表示，即提取率（mg/g）=15.01-5.58A+4.43B-0.066C-0.75D-1.47E-2.33F-4.74G。從方程可知，顆粒大小、乙醇濃度、提取溫度對辣椒堿提取率呈現(xiàn)負效應，而提取次數(shù)為正效應。而根據(jù)預試驗結果，提取次數(shù)超過3次后，辣椒堿提取率沒有出現(xiàn)明顯增加的趨勢，因此提取次數(shù)設為3次，其他因素采用單因素預試驗中的最優(yōu)條件：超聲功率為120 W，料液比為 1 g ∶ 6 mL，提取時間為10 min。

2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗的結果，選擇乙醇濃度、顆粒大小、提取溫度進行最陡爬坡試驗，試驗設計及結果如表6所示。

由表6可知，試驗3所得的辣椒堿提取率最高，因此選擇第3組試驗的條件作為響應面優(yōu)化的中心點，并設定第2、4組試驗條件為邊界條件，進行下一步的響應面優(yōu)化試驗。

2.3 響應面優(yōu)化試驗

為進一步確定超聲-溶劑提取辣椒堿的最優(yōu)工藝參數(shù)，以乙醇濃度、顆粒大小、提取溫度這3個因素為變量，辣椒堿提取率為響應值，進行Box-Behnken響應面優(yōu)化，結果如表7所示。

采用Design-Expert 10.0.7軟件對表7試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，獲得變量（乙醇濃度X1，顆粒大小X2、提取溫度X3）與響應值辣椒堿提取率（Y）之間的回歸模型方程：

Y=-92.106+5.135X1+19.167X2-0.098X3-3.263X1X2+0.024X1X3-0.058X2X3-0.045X12+119.167X22-0.016X32。

對該回歸模型進行方差分析，由表8可知，模型的P<0.000 1，而失擬項不顯著（P=0.243 8），說明該回歸模型高度顯著，擬合度良好，表明辣椒堿提取率的試驗值與預測值之間一致性好。響應值Y的R2為0.998 1，調(diào)整決定系數(shù)（Adj-R2）為0.994 8，說明回歸模型能在99.48%的概率上解釋試驗結果，僅有0.52%的變異不能由該模型解釋。因此，該回歸模型擬合程度較高，試驗誤差小，能準確分析和預測超聲-溶劑法的辣椒堿提取率。

進一步分析結果顯示，一次項乙醇濃度（X1）、顆粒大小（X2）、提取溫度（X3）、交互項（X1X2、X1X3）、二次項（X12、X32）對響應值的影響極顯著（P<0.01），二次項X22對響應值影響顯著（P<0.05），交互項X2X3不顯著（P>0.05）。

由圖1可以看出，乙醇濃度和顆粒大小之間以及乙醇濃度與提取溫度之間的交互作用最顯著，表現(xiàn)為響應曲面較陡，而提取溫度和顆粒大小之間交互作用不顯著。

通過軟件分析回歸模型，預測辣椒堿提取率的最優(yōu)工藝參數(shù)：乙醇濃度為60%，顆粒大小為80目，溫度為41.8 ℃，預測的辣椒堿提取率為53.98 mg/g。為進一步驗證BBD設計的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件對辣椒堿進行提取。另外考慮到實際操作的可行性，將提取條件設定為乙醇溫度60%，顆粒大小為80目，溫度為42.0 ℃，進行5次驗證試驗，提取率為（54.08±0.74） mg/g，與預測值的相對誤差<0.2%，說明回歸模型對辣椒堿提取率的預測非常可靠。

2.4 辣椒堿對害蟲的驅避作用

配制濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 mg/mL的辣椒堿-乙醇溶液，分析不同處理時間下辣椒堿濃度在對常見儲糧害蟲赤擬谷盜、谷蠹、玉米象的驅避作用（表9）。

由表9可知，在96 h的試驗時間內(nèi)，不同濃度的辣椒堿對3種儲糧害蟲均有一定的驅避作用，在辣椒堿濃度大于 8.0 mg/mL 時，驅避效果較好。總體上辣椒堿對赤擬谷盜和谷蠹的驅避效果相對較好，驅避作用持續(xù)時間長，但驅避效果有波動。而隨著辣椒堿濃度降低，處理時間延長，驅避效果有一定程度降低，可能由于害蟲對辣椒堿產(chǎn)生適應性，在試驗后期玉米象甚至還出現(xiàn)反驅避現(xiàn)象。

2.5 辣椒堿對害蟲的拒食作用

根據(jù)辣椒堿對害蟲驅避作用的試驗結果，選擇驅避作用較好的害蟲赤擬谷盜和谷蠹進行拒食試驗，辣椒堿濃度設為0.5、1.0、2.0 mg/g。試驗結果如圖2、圖3所示。

由圖2、圖3可知，在35 d的試驗時間內(nèi)，辣椒堿的添加使赤擬谷盜和谷蠹均表現(xiàn)出不同程度的拒食效果。在35 d處理時間點上，1.0 mg/g辣椒堿處理組的糧食損失量僅為對照組的43.17%（赤擬谷盜）、41.59%（谷蠹），拒食效果顯著。與對照相比，辣椒堿處理組糧食損失速率非常緩慢。總體上看，1.0、2.0 mg/g濃度的辣椒堿處理組之間表現(xiàn)出的拒食效果差異不顯著，因此糙米中辣椒堿濃度為1.0 mg/g時可對儲糧害蟲表現(xiàn)出較好的拒食效果。另外在試驗中還觀察到辣椒堿的添加降低了上述害蟲的繁殖速率，辣椒堿處理組中幼蟲數(shù)量遠低于對照組，這與歐陽建勛等的研究結果[2]相符。紀明山等通過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對小菜蛾（Plutella xylostella）有較強的產(chǎn)卵忌避和拒食作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對害蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉移酶和Na+，K+-ATP酶活性產(chǎn)生明顯作用[20]。因此，推測辣椒堿可能通過影響赤擬谷盜和谷蠹體內(nèi)相關重要酶的活性進而對這2種害蟲產(chǎn)生驅避和拒食作用。

3 結論

本研究通過PB設計、最陡爬坡試驗及BBD響應面試驗確定了辣椒堿的最優(yōu)提取工藝條件，最優(yōu)提取工藝參數(shù)是乙醇濃度為60%，顆粒大小為80目，溫度為41.8 ℃，提取次數(shù)3次，超聲功率為120 W，料液比為1 g ∶ 6 mL，提取時間為 10 min，在此條件下，辣椒堿提取率為（54.08±0.74） mg/g，與模型預測值相符;另外，辣椒堿濃度大于8.0 mg/mL時，對害蟲赤擬谷盜和谷蠹均表現(xiàn)出較好的驅避效果，而糙米中辣椒堿濃度為 1.0 mg/g 時，對上述2種害蟲則表現(xiàn)出明顯的拒食作用，辣椒堿處理組的糧食損失量僅為對照組的43.17%（赤擬谷盜）和41.59%（谷蠹），研究結果可為開發(fā)綠色、高效的儲糧害蟲防治技術提供一定的理論依據(jù)。

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