不同葡萄品種花粉生活力、花粉量及柱頭可授性的測定

辛董董　朱自果　候行行　連艷會　 閆丹丹　 張洋　李桂榮

摘要：以粉紅亞都蜜、紅巴拉蒂、里扎巴特、新西蘭攀金等4種葡萄品種的花粉為試驗材料，分別貯藏在-5、-10、-15、-20、-25、-30、-80 ℃溫度條件下，貯藏1、3、5 d，然后用200 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+ 8 g/L瓊脂固體培養基作為營養基質，進行花粉離體培養。結果發現，不同溫度處理下貯藏5 d后，紅巴拉蒂在-10 ℃下花粉生活力最高;粉紅亞都蜜在 -80 ℃ 下花粉生活力最高;新西蘭攀金在-20 ℃下花粉生活力最高;里扎巴特在-20 ℃下花粉生活力最高;不同品種的葡萄花粉量不同，摩爾多瓦的花粉量最多，為11 833±780個。柱頭可授性測定試驗結果表明，不同葡萄品種柱頭可授性強弱不同，摩爾多瓦的柱頭可授性最強，適合在雜交育種作母本。

關鍵詞：葡萄;花粉生活力;花粉量;柱頭可授性

中圖分類號： S663.101? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0113-04

近年來我國葡萄（Vitis vinifera L.）的種植面積逐漸擴大。在現代技術的引領之下，避雨棚、溫室等先進的栽培設施與配套的栽培技術相繼出現，加快了我國葡萄產業的發展[1]。先進的栽培設施雖然使我國葡萄產業迅速發展，但由于這類栽培設施都存在一個致命的缺陷——濕度過大，長期生長在這種高溫高濕、光照不足的人造小氣候環境內的葡萄，其抗性必然下降，培育出抗逆性強的優良葡萄品種，是今后葡萄育種的發展趨勢。在葡萄育種中最為重要的育種手段就是雜交育種[2-3]。雜交育種中，父母本的選擇是育種最重要的保證。花粉活力是評估花粉細胞活性的依據之一，高生活力的花粉、較多花粉量、較強柱頭可授性是雜交育種成功的一個重要前提，花粉生活力的高低、花粉量的多少、柱頭可授性強弱直接影響授粉、受精乃至坐果[4-8]。因此，在使用貯藏的葡萄花粉之前對其進行生活力的測定是保證雜交授粉獲得較高坐果率的關鍵步驟[9]。本試驗選取不同鮮食葡萄品種花粉，通過離體培養的方法，對不同溫度處理下的花粉生活力進行研究，探索最佳花粉的貯藏方法，通過血球計數板法測定不同鮮食葡萄品種花粉量，并采用聯苯胺-過氧化氫法測定葡萄品種柱頭可授性，探索柱頭可授性的強弱，旨在為葡萄育種中親和力強的父母本的選擇提供理論依據，有助于提高雜交授粉率，獲得較高的雜交后代率。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料于2017年5月5日取自中國農業科學院鄭州果樹所葡萄資源圃，鮮食葡萄品種有粉紅亞都蜜、紅寶石無核、美人指、無核白雞心、玫瑰香、里扎巴特、維多利亞、新西蘭攀金、金手指、摩爾多瓦、紅巴拉蒂、弗蕾無核、黑色甜菜等，共計13個。

1.1.1 花粉采集 在葡萄初花期選擇紅巴拉蒂、粉紅亞都蜜、新西蘭攀金、里扎巴特等4個品種生長健壯的植株，隨機取下發育正常的花序，分別裝入保鮮袋，再放入裝有冰袋的保溫箱內帶回河南科技學院實驗室。除去花序頂部發育較差的花蕾后，取出花藥，放在墊有硫酸紙的培養皿中，及時剔除其中的雜質和破裂的花藥，然后將培養皿放置在陰涼干燥處自然陰干，室溫條件下，經一定時間后花粉開裂，待花粉完全散出干燥后倒入研缽中研磨，經過花粉篩除去雜質，收集備用。

1.1.2 花粉貯藏 將葡萄花粉分別裝入2 mL離心管中，封口膜密封管口，貼上標簽。然后將裝有花粉的離心管分別放入裝有100 mL/L氯化鈣的干燥器中保存，在-5、-10、-15、-20、-25、-30、-80 ℃溫度條件下貯藏。各貯藏條件下的花粉分別間隔1、3、5 d進行觀察。

1.2 方法

1.2.1 花粉生活力測定 采用離體萌發法測定花粉萌發率。將配置好的培養基（200 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+ 8 g/L瓊脂）倒入干凈的培養皿中，待其冷卻凝固后備用。利用牙簽蘸取貯藏在不同溫度下的不同葡萄品種花粉（每個溫度條件下的每個葡萄品種更換一個牙簽，防止交叉污染），然后輕輕抖動牙簽將花粉均勻撒落到培養基上，標記，放在25 ℃的恒溫培養箱中進行培養，分別在培養1、2、3、5 h后進行花粉萌發情況的觀察，一般以萌發后花粉管長度超過花粉粒直徑的 1/2 來作為花粉粒萌發的標準。每個離體培養的花粉用倒置顯微鏡觀察3個區域，并記錄花粉粒的萌發數與總數，花粉萌發率=視野內萌發的花粉粒數/視野內花粉粒的總數×100%。

1.2.2 花粉量的測定 采用血球計數板法測定花粉量。將初期葡萄花序帶回實驗室并剝去外邊2～3輪小花花藥，每個品種取30枚花藥放入干凈的10 mL離心管中（貼標簽），立即放入50 ℃烘箱中烘干。花藥完全裂開花粉散出后加入20%的六偏磷酸鈉溶液，定容至6 mL，然后振蕩搖勻成懸浮液，用移液槍吸取2 μL懸浮液滴在血細胞計數板上用普通顯微鏡（10×40倍）進行觀察，統計花粉量，花粉量=（80小格內的花粉數/80）×400×10 000×600，重復3次，計算平均值。

1.2.3 柱頭可授性的測定 采用聯苯胺-過氧化氫法測定葡萄品種柱頭可授性。取無核白雞心、維多利亞、玫瑰香、弗蕾無核、摩爾多瓦、黑色甜菜、金手指、紅寶石無核、美人指等9個品種葡萄不同發育時期新鮮單花柱頭（含苞待放、半開放、完全開放）各30枚，完全浸泡在反應液V（1%聯苯胺） ∶ V（3%過氧化氫） ∶ V（水）=4 ∶ 11 ∶ 22中，15 min后在T式顯微鏡下觀察，根據染色強弱和氣泡量劃分可授性能力強弱。

1.3 數據處理及分析

采用Excel 2003和DPS 9.50進行數據統計處理與分析。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄品種花粉生活力的比較

研究發現，紅巴拉蒂花粉在-25 ℃的條件下進行貯藏最適宜，且貯藏3 d效果最好，花粉生活力達到（16.80±1169）%（表1、圖1-A）;在-30 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最高，達到（1124±4.75）%;在-20 ℃的條件下貯藏 3 d 的花粉生活力最高，達到（10.74±6.10）%;在-5、-10、-15、-80 ℃的條件下貯藏5 d后的花粉生活力最高，分別達到（16.54±4.65）%、（16.67±648）%、（16.63±6.69）%、（12.23±5.29）%;在-30 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最低（表1、圖1-B）。因此，紅巴拉蒂適于在-25 ℃的條件下貯藏3 d。粉紅亞都蜜花粉在 -30 ℃ 的條件下貯藏1 d的生活力最高，達到（6.79±049）%;在-25 ℃的條件下貯藏3 d的生活力最高，達到（6.17±3.27）%;在-5、-10、-15、-20、-80 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最高，分別達到（670±0.58）%、（6.58±1.63）%、（5.25±084）%、（5.09±1.81）%、（7.94±337）%;在-80 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最低，因此，粉紅亞都蜜在-30 ℃的條件下貯藏1 d可以作為雜交育種的父本材料。新西蘭攀金花粉在-10、-15 ℃的條件下貯藏 1 d 的生活力最高，達到（7.44±0.29）%、（644±0.29）%;在 -80 ℃ 的條件下貯藏3 d的生活力最高，達到（8.48±285）%;在-20、-25 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最高，分別達到（833±6.31）%、（7.23±3.96）%;在-80 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最低。新西蘭攀金在 -80 ℃ 的條件下貯藏3 d效果最好，因此，新西蘭攀金在 -80 ℃ 的條件下貯藏3 d可以作為雜交育種的父本材料。里扎巴特花粉在-10 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最高，達到（8.96±2.01）%;在-5、-80 ℃的條件下貯藏3 d的生活力最高，達到（12.03±7.32）%、（8.22±4.32）%;在-15 ℃、-20 ℃、-25 ℃、-30 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最高，分別達到（8.45±0.41）%、（9.97±3.68）%、（8.52±2.37）%、（6.56±0.87）%;在-80 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最低（表1）。里扎巴特在-5 ℃的條件下進行貯藏最為適宜，且貯藏3 d效果最好，因此，里扎巴特在-5 ℃的條件下貯藏3 d可以作為雜交育種的父本材料。結果表明，紅巴拉蒂的生活力最強，新西蘭攀金次之，再次是里扎巴特，粉紅亞都蜜最弱。因此，在雜交育種中可以選擇紅巴拉蒂作為父本材料。

2.2 不同葡萄品種單花藥花粉量的比較

研究發現，不同葡萄品種單花藥花粉量不同，其中紅巴拉蒂的單花藥花粉量最多，為11 833±780個;在0.05水平下，粉紅亞都蜜、新西蘭攀金、里扎巴特3種葡萄的單藥花粉量與紅巴拉蒂的單藥花粉量差異顯著，花粉量分別為（11 467±305）、（11 000±153）、（10 267±338）個;在0.01水平下，粉紅亞都蜜、新西蘭攀金、里扎巴特3種葡萄的單藥花粉量與紅巴拉蒂的單藥花粉量均差異不顯著（表2）。

2.3 不同葡萄品種柱頭可授性的比較

研究發現，不同葡萄品種柱頭氣泡數不同，其中摩爾多瓦在已開放花期時的柱頭氣泡數最多，為29個， 說明此柱頭的過氧化物酶活性最強，柱頭可授性最強（表3）。紅寶石無核含苞待放、半開放花期時的柱頭氣泡數最少，為4個，說明此柱頭的過氧化物酶活性最弱，柱頭可授性最弱。弗蕾無核、黑色甜菜、紅寶石無核、美人指的3個花期的柱頭氣泡數目普遍偏少，平均分別為9、9、4、6個，說明這些葡萄品種的柱頭過氧化物酶活性較弱，柱頭可授性也比較弱。無核白雞心、維多利亞、玫瑰香、摩爾多瓦、金手指3個花期的柱頭氣泡數目普遍較多，平均分別為18、18、23、20、13，說明這些葡萄品種的柱頭過氧化物酶活性較強，柱頭可授性也比較強，其中，玫瑰香3個花期的氣泡數目的平均值最大，且在已開放花期的時候，柱頭經過染色顏色最深、氣泡數目最多（圖2-A），紅寶石無核3個花期的氣泡數目的平均值最小，且在已開放花期的時候，柱頭經過染色顏色比較淺、氣泡數目比較少（圖2-B）。因此，在雜交育種過程中，可以選擇已經開放的摩爾多瓦葡萄品種作母本材料。

研究發現，根據聯苯胺-過氧化氫法檢測不同葡萄品種柱頭的可授性， 其中維多利亞、摩爾多瓦、黑色甜菜、金手指、

美人指葡萄品種在含苞待放、半開放各花期的柱頭均表現有最強的可授性。無核白雞心半開放花期表現為最強的可授性，而已開放、含苞待放花期的柱頭均表現有較強的可授性。玫瑰香半開放、已開放花期的柱頭表現為最強的可授性，而含苞待放的柱頭均表現有較強的可授性（表4）。

3 結論與討論

本試驗對不同鮮食葡萄品種不同溫度處理下花粉生活力、花粉量測定以及柱頭可授性進行了研究，為葡萄育種中父本花粉生活力的測定、花粉量測定、母本柱頭可授性測定及其選擇提供理論依據，有助于葡萄雜交育種獲得抗性強的父母本葡萄品種，父母本如果花期不同，可以將父本的花粉在適宜的條件下貯藏起來，以達到調節花期的目的，且保證貯藏后的花粉具有較強的生活力，才能確保后期雜交授粉的成功[10-12]。保證花粉生活力強弱的重要因素是要具有適當的貯藏條件，比如在干燥、低溫的環境條件下，能夠較好地保持花粉的生活力，以供不同雜交組合和不同時期的雜交育種。不同葡萄品種花粉的生活力存在著較大的差異。選擇花粉生活力強的父本和配制良好的雜交組合，是保證雜交育種工作成功的重要依據[13-15]。

花粉的貯藏溫度和濕度是影響花粉貯藏時間長短的主要因素[16]。在高溫、高濕的情況下，花粉酶的水解活性增強，代謝作用也加強，并且進行著強烈的呼吸作用，消耗大量養分，且易被微生物感染發霉變質而喪失萌發率。花粉貯藏過程中，保持較低的環境濕度，可以使其代謝受到抑制，酶活性減弱，呼吸作用降低，使花粉活力維持較長時間，貯藏花粉的壽命往往與環境相對濕度呈負相關[17-18]。本試驗研究表明，-25、-30 ℃貯藏條件下葡萄干燥花粉的貯藏效果最好，隨著貯藏時間的延長，花粉生活力逐漸降低，主要原因是花粉內養分逐漸消耗，酶活性逐漸降低;在-5 ℃條件下花粉生活力下降最為迅速，主要原因是貯藏溫度較高，花粉內酶活性較強，代謝作用加快，過度消耗花粉內貯藏的養分;而-15、-20 ℃ 條件就處于二者之間，是短期貯藏最為理想便捷的貯藏方式。

柱頭可授性影響授粉成功率。不同植物柱頭可授期持續時間不等，花朵的開放期、柱頭分泌物的有無等對它都有影響[19-20]。本試驗研究發現不同葡萄品種柱頭可授性強弱不同，其中維多利亞、摩爾多瓦、黑色甜菜、金手指、美人指葡萄品種的含苞待放、半開放、已開放3個花期的柱頭都表現為最強的可授性。紅寶石無核的未開、半開、已開3個花期的柱頭均表現有較強的可授性。無核白雞心半開表現為最強的可授性，而已開、未開花期的柱頭均表現有較強的可授性。玫瑰香半開、已開花期的柱頭表現為最強的可授性，而未開的柱頭均表現有較強的可授性。弗苗無核在含苞待放、半開花期的柱頭表現為最強的可授性，而在已開的柱頭表現為較強的可授性。

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