農桿菌介導的水稻快速高效基因轉化系統

高璐　薛永來

摘要：農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系被廣泛應用于水稻功能基因研究、T-DNA插入突變體庫創建和農藝性狀改良等研究領域。然而水稻轉基因操作需要超過3個月的組織培養時間。運用組織培養和農桿菌介導的遺傳轉化技術，對水稻遺傳轉化體系進行快速高效的優化。結果表明，成熟種子用2，4-D誘導愈傷7 d后，與農桿菌共培養轉化效率最佳;抗性篩選時間以2～4周為最佳。根據以上優化條件，從成熟種子誘導愈傷至獲得轉基因株系的時間被縮短到6周左右。將有效降低水稻長時間組培導致的體細胞無性系變異概率，對促進水稻分子育種的發展有重要意義。

關鍵詞：粳稻;農桿菌介導;遺傳轉化

中圖分類號： S511.2+20.1? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0039-03

水稻高效遺傳轉化體系的建立是進行水稻功能基因分析、創建T-DNA插入突變體庫和分子遺傳改良的技術基礎。然而一般來講，在獲得水稻轉基因株系前，至少需要3個月以上的組織培養時間，這使得水稻的分子生物學相關研究周期遠比其他物種漫長。另有文獻報道，長時間的體外組織培養可能引起水稻愈傷組織的無性系變異，導致基因組改變[1]。因此建立高效快速的轉化體系，不僅能夠提高操作效率，還可以盡可能地減少細胞無性系變異，對水稻基因工程研究有重要意義[2-6]。

研究認為，水稻成熟種子誘導愈傷培養至少2～3周后，獲得的愈傷組織才適用于農桿菌侵染[1，7-8]。但是Toki等曾報道農桿菌介導的高速的水稻轉基因體系，認為在水稻愈傷培養1 d后即可進行侵染共培養試驗[9]。但也有研究認為早期侵染并不能獲得足夠的陽性抗性愈傷，轉化率低于10%[10]。本研究就水稻遺傳轉化體系中預培養以及抗性篩選階段的條件進行摸索，在保證高效農桿菌轉化率的同時，建立既高效又高速的水稻遺傳轉化體系。

1 材料與方法

試驗于2015年12月至2016年10月在江蘇大學環境與安全工程學院生物質能源研究所能源植物研究室進行。使用的水稻（Oryza sativa）品種為日本晴和南粳9108。

1.1 質粒構建

本研究使用的表達載體pBINPLUS為筆者所在實驗室保存，在AscⅠ和PacⅠ酶切位點之間插入RbcS1啟動子和終止子序列，構建成pBINR載體，將該載體使用凍融法導入農桿菌植株EHA105中[11]。

1.2 培養基

本試驗所使用各種培養基均列于表1中。

1.3 植物材料與預培養

試驗使用粳稻品種日本晴和南粳9108由江蘇省農業科學院提供，其中南粳9108為江蘇省內及周邊地區廣泛種植的推廣品種。水稻種子剝去穎殼加1滴含吐溫-20的5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，然后用無菌水清洗5遍。然后再用無吐溫的次氯酸鈉溶液消毒15 min，并用無菌水沖洗10遍左右，徹底去除次氯酸鈉殘留。用無菌濾紙吸干種子表面水分后，種子胚向上斜插到NBD培養基上，16 h光照/8 h黑暗，28 ℃培養。每皿放置20粒種子，每個處理設6個重復。

1.4 農桿菌侵染及轉基因植物篩選

挑取含有pBINR載體的農桿菌單菌落于含有50 mg/L卡那霉素的AAM液體培養基中，28 ℃遮光200 r/min振蕩培養至D600 nm為0.4～0.6，離心收集菌體并用液體NB-As重懸至D600nm=0.1。選取大小合適、狀態良好的的愈傷組織，浸入農桿菌重懸液中30 min，在無菌濾紙上吸干多余菌液后，將愈傷組織轉移到鋪有1層無菌濾紙的固體NBD-As培養基上，暗培養3 d。將愈傷用無菌水清洗3遍，之后用含有 150 mg/L Timentin的無菌水浸泡10 min，將愈傷多余水分吸干，轉移至NBD-As培養基恢復培養4 d。之后轉移到含有篩選抗生素卡那霉素的NBD-TK培養基上繼續篩選培養，每2周繼代1次。有卡那霉素抗性的愈傷組織轉移入分化培養基RE1中，催化的不定芽生長至3～5 cm小苗時，將小苗切割并轉入生根培養基RE2中進行生根誘導，獲得T0代幼苗。

1.5 轉基因植物的分子鑒定

取T0代幼苗葉片0.1 g，采用TaKaRa植物基因組DNA小量純化試劑盒（No. 9768）提取水稻總DNA。根據RbcS1啟動子和終止子序列避開水稻同源序列，設計合成引物，序列為P1：5′-TTTAGGAGATACCAGCCAGG-3′;P2：5′-AACTTAGTAGCCATCGGGC-3′，PCR退火溫度為55 ℃，循環次數為30次。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，在 800 bp 左右有目的條帶即為陽性。

2 結果與分析

2.1 預培養條件對水稻愈傷培養的影響

水稻胚誘導愈傷組織受到多方面因素的影響。本試驗發現種子的狀態和光照對水稻愈傷的生長有明顯影響。優良的種子狀態是愈傷生成的關鍵因素（表2）。在剝除穎殼的過程中根據形態等因素對種子進行初步篩選，對后期水稻愈傷組織的成功誘導有很重要的作用。另外，對比暗培養和光照培養的水稻愈傷發現，光照培養下的愈傷組織生長更快，呈淺黃色且較致密，更有利于縮短培養時間和分化誘導。

2.2 預培養時間對農桿菌侵染轉化效率的影響

預培養時間對日本晴和南粳9108這2個品種的轉化率有明顯的影響。經過2～3次繼代的愈傷轉化效率最高，明顯高于培養4周未繼代直接侵染的愈傷組織。繼代超過4次的2個品種的轉化率均開始明顯下降，同時分化能力也明顯下降。說明長時間的誘導愈傷培養對水稻基因轉化率和分化率都有影響。研究發現2個品種預培養4 d和7 d后直接進行農桿菌侵染，也能獲得較高的轉化率，其中預培養7 d后的基因轉化率高達69.0%和61.7%，接近繼代2～3次后水稻愈傷組織的轉化效率（表3）。

2.3 篩選時間對分化效率的影響

水稻愈傷組織與農桿菌共培養后，被轉入含有篩選抗生素的篩選培養基上，以篩選出成功將目的基因整合入植物基因組的陽性克隆。為提高農桿菌侵染效率，將農桿菌菌體收集并用 NB-As 培養基重新懸浮菌體至 D600 nm為0.1。 試驗證明，較低的農桿菌密度不但能夠提高轉化效率（數據未顯示），并且容易洗清，避免因農桿菌生長旺盛無法徹底去除而將愈傷組織包埋、影響愈傷組織生長的現象。

篩選培養的時間對愈傷組織分化效率也有影響。篩選時間太短，假陽性克隆太多，加大了后期分子生物學鑒定的工作量;篩選時間太長，不但拖延科研時間，還會出現因愈傷組織培養時間太長而導致分化能力下降的現象。如表4所示，篩選培養繼代2次以內，水稻愈傷組織的分化效率在80%左右，隨著繼代次數的增加，分化效率有降低的趨勢，且延長是整個體系的操作時間。

2.4 轉基因水稻幼苗的PCR驗證

將生根后的不定芽幼苗從培養基中取出，移栽到含有營養土的水桶中，在溫室中栽培，即可繼續生長直至收獲。為進一步鑒定陽性植株中目的基因的存在，對T0代幼苗的葉片進行PCR鑒定。結果如圖1所示，2個水稻品種的轉化率沒有差異，說明本體系對該2個品種均適用。同時篩選培養時間對水稻的植株轉化率也沒有明顯影響（數據未顯示）。

3 討論與結論

水稻是我國重要的糧食作物，也是農業科學和植物學研究的重要模式植物。建立高效的水稻轉化體系，是水稻功能基因研究、性狀改良、抗性提高等科學研究的技術基礎。自1994年Hiei等報道水稻轉基因技術以來，國內外的科研工作者通過培養基改良、操作步驟優化等措施，不斷改進優化水稻的基因轉化體系，實現了水稻轉化率的大幅提高[7，9-10，12-16]。近年來，無選擇標記技術更是廣泛應用于水稻新品系的培育[17-19]。試驗材料是水稻農桿菌轉化的重要基礎。本研究采用成熟種子為試驗材料，材料簡單易得，經過初步的篩選，愈傷誘導率可以高達90%以上，預培養7 d作為轉化的受體材料，轉化率可達60%～70%，完全滿足研究需要。本系統使用較高濃度的次氯酸鈉和吐溫-20對水稻種子進行2次消毒。該方法簡單易行，在實際操作中污染率基本為零，而且同時還去除了種子表面各種油和蠟質，有利于農桿菌的順利侵染[9]。光照在水稻種子萌發和愈傷生成中也有重要的作用，與暗培養相比較，長日照條件下培養的愈傷組織生長更快、結構更加緊密，這種愈傷有利于后期芽的分化[10，14，20-22]。

本研究主要針對水稻轉基因體系中耗時較長的2個步驟（即愈傷組織預培養和抗性篩選過程）進行優化。過去的大量研究中，水稻在含有2，4-D的培養基上培養28 d以上，誘導出足夠的愈傷組織用來轉基因操作。Toki等曾報道，愈傷誘導1～5 d后用農桿菌侵染即可獲得較高的轉化率[9]。但是筆者多次試驗并沒有達到文獻報道的高轉化率。結合前期經驗，對水稻轉基因部分步驟進行摸索優化，最終發現，在含有2，4-D的培養基上培養7 d后，與農桿菌共培養，能獲得可接受的高轉化率，且結果穩定。同時較低濃度的農桿菌不僅能夠獲得更高的轉化率，還避免了后期因農桿菌濃度過高引起的愈傷感染過度或農桿菌污染引起的愈傷褐化死亡[13，15，22]。在抗性篩選階段，研究發現2周以上的抗性篩選過程即可有效地去除未整合目的基因的陰性愈傷，同時獲得高效分化的陽性愈傷組織。以上結果與文獻報道結果[13，15，20-23]相似，且得到后期分子生物學手段驗證。通過以上2個步驟的優化，將水稻轉基因操作體系縮短到6周以內，提高了工作效率，對于水稻的功能基因研究乃至分子遺傳育種都有重要意義。

在農作物生理生化和分子遺傳育種研究工作中，水稻轉基因體系已經是必不可少的技術平臺之一。本研究通過優化預培養和抗性篩選2個步驟，縮短了水稻轉基因的操作周期，為提高科研效率提供了可能。同時，根據該項研究的結果，可對其他水稻品種以及禾本科其他植物的轉化進行優化研究。本體系的擴大應用將有助于利用分子生物學手段對禾本科植物的功能基因組和農藝價值改良的深入研究。

參考文獻：

[1]Labra M，Savini C，Bracale M，et al. Genomic changes in transgenic rice （Oryza sativa L.） plants produced by infecting calli with Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports，2001，20（4）：325-330.

[2]呂 彥，王平榮，孫業盈，等. 農桿菌介導遺傳轉化在水稻基因工程育種中的應用[J]. 分子植物育種，2005，3（4）：543-549.

[3]張 欣，付亞萍，周君莉，等. 水稻規?；D基因技術體系構建與應用[J]. 中國農業科學，2014，47（21）：4141-4154.

[4]Yamauchi T，Iida S.Gene targeting in crop species with effective selection systems[M]. Double-strand break repair and its application to genome engineering in plants. New York：Springer，2015：91-111.

[5]顏文飛，張啟軍，秦海龍，等. 運用農桿菌介導的針刺法將外源基因轉入水稻[J]. 江蘇農業學報，2015，31（4）：718-724.

[6]張喜娟，來永才，孟 英，等. 粳稻轉基因技術體系的研究與應用進展[J]. 黑龍江農業科學，2017（4）：136-139.

[7]Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. The Plant Journal，1994，6（2）：271-282.

[8]Hiei Y K T，Kubo T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Molecular Biology，1997，35（1/2）：205-218.

[9]Toki S，Hara N，Ono K，et al. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice[J]. The Plant Journal，2006，47（6）：969-976.

[10]陳 惠，趙 原，種 康. 一種改進的水稻成熟胚愈傷組織高效基因轉化系統[J]. 植物學通報，2008，25（3）：322-331.

[11]Holsters M，de Waele D，Depicker A，et al. Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens[J]. Molecular & General Genetics，1978，163（2）：181-187.

[12]Komari T，Hiei Y，Ishida Y，et al. Advances in cereal gene transfer[J]. Current Opinion in Plant Biology，1998，1（2）：161-165.

[13]牟 晨，金 菁，石金磊. 根瘤農桿菌介導的水稻轉基因方法的

優化研究[J]. 安徽農業科學，2012，40（7）：3867，3880.

[14]王北艷，向殿軍，殷奎德. 提高粳稻成熟胚抗性愈傷再生頻率的研究[J]. 黑龍江八一農墾大學學報，2012，24（1）：28-31.

[15]周 艷，黃亞萍，周 遙，等. 農桿菌介導的遺傳轉化秈稻Kasalath的條件優化[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版），2013，39（5）：471-477.

[16]易自力，曹守云，王 力，等. 提高農桿菌轉化水稻頻率的研究[J]. 遺傳學報，2001，28（4）：352-358.

[17]段忠衛，李希臣，張 軍，等. 無選擇標記轉高賴氨酸蛋白基因水稻植株的培育[J]. 東北農業大學學報，2013，44（7）：46-51.

[18]馮夢詩，葉 俊，侯莉莉，等. 無選擇標記基因的優質香稻新品系培育[J]. 華北農學報，2015，30（5）：92-96.

[19]Mejima M，Kashima K，Kuroda M，et al. Determination of genomic location and structure of the transgenes in marker-free rice-based cholera vaccine by using whole genome resequencing approach[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2015，120（1）：35-48.

[20]王春萍，謝樹章，蔣曉英，等. 農桿菌介導的秈稻科恢675快速遺傳轉化體系的建立[J]. 西南農業學報，2012，25（1）：1-5.

[21]李素娟，樊秀霞，王 華，等. 水稻不同品種組培再生和轉基因頻率研究[J]. 核農學報，2013，27（12）：1817-1827.

[22]張燕紅，趙志強，吳澤新，等. 根癌農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系的研究[J]. 新疆農業科學，2014，51（8）：1457-1462.

[23]周 蕾，陳 晨. 農桿菌介導水稻遺傳轉化方法的優化研究[J]. 農業與技術，2015，35（17）：33-34，37.仵 陶，安勝軍，邵鐵梅，等. 微型人胰島素基因載體的構建及其在花生中的表達[J]. 江蘇農業科學，2019，47（4）：42-46.