原發性腎病綜合征患者尿液中podocalyxin、nephrin的表達及意義

吳好好　鄭心彤　黃海庭　林栩

【摘要】 目的 探討不同病理類型的原發性腎病綜合征患者尿中podocalyxin、nephrin的表達及意義。方法 將80例原發性腎病綜合征患者，按照病理分為微小病變性腎病（MCN）組22例、系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）組11例、膜性腎病（MN）組36例、局灶性節段性腎小球硬化（FSGS）組11例，另設20例健康人為對照組。通過酶聯免疫吸附法檢測各組尿中podocalyxin、nephrin的表達，并分析其與24小時尿蛋白、血清白蛋白、血脂、肌酐的相關性。結果 FSGS組尿podocalyxin、nephrin高于其他腎病綜合征組和正常對照組（P<0.05），其他腎病綜合征組高于正常對照組（P<0.05）;MsPGN組尿podocalyxin、nephrin低于其他腎病綜合征組（P<0.05），其在MCN、MN組表達差異無統計學意義（P>0.05）;不同病理類型腎病綜合征組尿podocalyxin、nephrin的表達與血清白蛋白呈負相關，與24小時尿蛋白、血脂、肌酐水平呈正相關（P均<0.05）。結論 尿podocalyxin、nephrin的表達水平與腎病綜合征病理類型及疾病嚴重程度相關，可作為判斷腎病綜合征病理類型和預后的參考指標。

【關鍵詞】 原發性腎病綜合征;podocalyxin;nephrin;足細胞損傷

中圖分類號：R692.6? ?文獻標志碼：A? ?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.06.004

【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of podocalyxin and nephrin in urine of patients with different pathological types of primary nephrotic syndrome.Methods According to pathology，80 patients with primary nephrotic syndrome were divided into minimal change nephropathy（MCN） group（22 cases），mesangial proliferative glomerulonephritis（MsPGN） group（11 cases），membranous nephropathy（MN） group（36 cases） and focal segmental glomerulosclerosis（FSGS） group（11 cases）.In addition，20 healthy people were selected as control group.And then，the expression of podocalyxin and nephrin in urine was detected by enzymelinked immunosorbent assay，and its correlation with 24hour urinary protein，serum albumin，blood lipid and creatine was analyzed.Results The urinary podocalyxin and nephrin in the FSGS group were higher than those in other nephrotic syndrome groups and the control group（P<0.05），while those in other nephrotic syndrome groups were higher than those in the control group（P<0.05）.The urinary podocalyxin and nephrin levels in MsPGN group were lower than those in other nephrotic syndrome groups（P<0.05），and there was no statistically significant difference in the expressions of podocalyxin and nephrin between the MCN group and the MN group（P>0.05）.The expression of urinary podocalyxin and nephrin in different pathological types of nephrotic syndrome was negatively correlated with serum albumin，and positively correlated with 24hour urinary protein，blood lipid and creatine level（all P<0.05）.Conclusion The expression levels of urinary podocalyxin and nephrin are related to the pathological type and severity of nephrotic syndrome，which can be used as a reference index to judge the pathological type and prognosis of nephrotic syndrome.

【Key words】 primary nephrotic syndrome;podocalyxin;nephrin;podocyte injury

原發性腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是常見的腎小球疾病，腎小球足細胞損傷是該病發生發展的重要環節。眾多研究表明通過檢測尿液中足細胞相關蛋白的含量可以間接反映尿液中足細胞數量的多少，進而判斷腎小球足細胞損傷程度。因此本實驗擬通過探討足細胞相關蛋白podocalyxin、nephin在原發性NS不同病理類型患者尿液中的表達與臨床相關指標（尿蛋白、白蛋白等）的相關性，為NS診斷及預后判斷提供新思路。

1 資料與方法1.1 研究對象 收集2016年8月至2017年8月在右江民族醫學院附屬醫院及百色市人民醫院腎內科首次住院經臨床及腎臟病理檢查診斷為原發性腎病綜合征患者的尿液共80例，男性43人，女性37人，年齡11～78歲，平均（37.75±16.81）歲;排除狼瘡性腎炎、藥物中毒、糖尿病腎病、細菌感染、紫癜性腎炎、腎淀粉樣變、乙肝病毒相關性腎炎、腫瘤性腎病等繼發性腎病綜合征。其中微小病變性腎病（MCN）22例，男性13人，女性9人，平均（24.55±12.27）歲;系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）11例，男性7人，女性4人，平均（36.27±10.96）歲;膜性腎病（MN）36例，男性17人，女性19人，平均（47.56±14.80）歲;局灶節段性腎小球硬化（FSGS）11例，男性6人，女性5人，平均（33.55±16.62）歲。隨機選取同期健康體檢的20例健康者作為對照組，男性11人，女9人，年齡12～78歲，平均（3995±17.80）歲。原發性腎病綜合征組患者的性別、年齡與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經右江民族醫學院附屬醫院和百色市人民醫院倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 血液標本收集及檢測 80 例患者于治療前采集清晨空腹靜脈血 3 mL，同期采集健康對照者靜脈血 3 mL，采用全自動生化分析儀檢測血清白蛋白、膽固醇、甘油三酯、肌酐水平。

1.2.2 尿液標本的收集與處理 收集不同病理類型患者清晨首次清潔中段尿10 mL，并收集健康對照組患者的尿液標本，2500 r/min離心，10 min后將上清保存在-20℃低溫冰箱，避免反復凍融，用于podocalyxin、nephrin的檢測。同樣處理的相同尿液保存在-80℃超低溫冰箱，備用。

1.2.3 主要儀器與試劑 Rayto 酶聯儀，人podocalyxin、nephrin ElISA檢測試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.2.4 尿podocalyxin、nephrin檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測。檢測步驟有如下幾步。（1）標準品配制：標準品（10 ng）離心1 min，加入樣品稀釋液 1 mL，充分溶解后，室溫下靜置 10 min，使其濃度為 10 ng/mL。準備 7 個 1.5 mL EP 管，每管加入 500 μL 樣品稀釋液，然后做倍比稀釋使這7個 1.5 mL EP 管內配成的濃度分別為 5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0312 ng/mL、0.156 ng/mL、0 ng/mL，最后從第6管中吸出 500 μL 棄去其中，樣品稀釋液直接作為標準濃度 0 ng/mL，每份稀釋后振蕩器震蕩數秒使其混勻。（2）加樣：分別設置空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液50 μL，余下的孔分別加標準品或待測樣品50 μL，立即每孔加入生物素化抗體工作液50 μL。加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，給酶標板覆膜， 37℃孵育45 min。（3）洗板：棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，大約350/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。（4）加入酶結合物工作液：每孔加入酶結合物工作液 100 μL，加上覆膜，37℃溫育30 min。（5）洗板：棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，大約350/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。（6）加入底物溶液：每孔中加入底物溶液（TMB） 90 μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 min左右（不能超過30 min）。（7）加入終止液：每孔中加終止液50 μL，終止反應，此時藍色立即轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。（8）立即用酶標儀在 450 nm 波長測量各孔的光密度（OD值）。（9）利用 Curveexpert 1.4 軟件繪制出標準曲線，然后依據標本的OD值在標準曲線上求出podocalyxin、nephrin的濃度（ng/mL）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，比較podocalyxin、nephrin在不同病理類型腎病綜合征的表達采用單因素方差分析，兩兩比較時，方差齊使用LSD法，方差不齊則使用GamesHowell法，相關性分析采用Pearson相關分析，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結? 果2.1 各組臨床相關指標的比較 與對照組相比，各組24 h尿蛋白均升高，血清白蛋白不同程度降低，并伴有血脂、肌酐升高。見表1。

2.2 各組尿液中podocalyxin、nephrin的表達水平 podocalyxin、nephrin在正常人及腎病綜合征組患者尿液中均存在，對照組尿液中podocalyxin、nephrin的表達顯著低于腎病綜合征組（P<0.05）。腎病綜合征MsPGN組尿液中podocalyxin、nephrin的表達最低、FSGS組最高;MN組與MCN組尿podocalyxin、nephrin差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組尿液中podocalyxin、nephrin與臨床指標的相關分析 各組尿液中podocalyxin、nephrin的表達與24 h尿蛋白呈正相關（r=0.60，r=0.56，P均<005）;與血清白蛋白呈負相關（r=-0.47，r=-058，P均<005）;與膽固醇呈正相關（r=044，r=037，P均<005）;與甘油三酯呈正相關（r=048，r=032，P均<005）;與肌酐呈正相關（r=024，r=030，P均<005）。見表3。