糞腸球菌ace陽性和陰性菌株體外生物被膜形成能力比較

細菌生物被膜在腸球菌感染中起重要作用。導尿管、前列腺小管、口腔感染根管、感染性性心內膜炎瓣膜等感染部位均可觀察到腸球菌生物膜的存在[1-2]，研究腸球菌生物被膜形成的上調或抑制基因，探討腸球菌生物被膜形成的分子機制，成為腸球菌致病機制的研究方向之一。已有研究表明腸球菌表面蛋白esp、明膠酶gelE、分選酶srt、腸球菌調節因子fsr和增強子結合蛋白ebpR等基因與腸球菌的生物膜形成相關[3-7]。糞腸球菌膠原結合蛋白ace(糞腸球菌膠原粘附素)，是腸球菌的表面粘附蛋白，在腸球菌泌尿道感染以及心內膜炎感染中具有毒力作用[8]。同時，這些部位的感染也與細菌生物被膜的存在密切相關。近年來，人們發現一些細菌粘附素除了啟動對宿主的感染外，對生物被膜的形成也有貢獻[9-10]。腸球菌Ace的毒力機制除了促進細菌與宿主細胞的粘附外，是否也還有利于細菌間生物被膜的形成值得探討。本文對糞腸球菌臨床分離株的生物膜形成能力與ace基因的相關性進行分子流行病學分析，并通過本室構建的一對ace基因轉化變異株，采用微量滴定板法以及共聚焦顯微鏡觀察比較ace+、ace-糞腸球菌體外生物膜形成能力的差異，探討糞腸球菌ace基因產物影響生物膜形成的致病機制。

1 材料與方法

1.1菌株及質粒 46株糞腸球菌臨床分離株分離自福建醫科大學附屬協和醫院及福建省立醫院就診患者的尿液、膽汁、腹腔液和心瓣膜、留置導尿管等臨床標本。標準菌株ATCC29212(ace+)購自衛生部臨床檢驗中心，糞腸球菌ace陰性野生株U8-ace-(壯觀霉素敏感)，分離自泌尿道感染臨床標本。糞腸球菌空質粒對照株EU8-ace-、糞腸球菌轉化株ZU8-ace+本實驗室構建保存。大腸桿菌XL1-Blue 含pTEX5646(pAT 392穿梭質粒，整段ace基因，攜壯觀霉素抗性)德克薩斯大學醫學院Barbara E. Murray教授饋贈。

1.2主要試劑及儀器 BHI培養液、MH肉湯為美國 Difco公司產品；PCR試劑與 TaqDNA聚合酶為寧波基內公司產品；吖啶橙(AO)、溴化乙錠(EB)為Sigma公司產品。35 mm培養皿、10 mm培養皿、96孔微量滴定板為 Corning Incorporated產品。Gene Amp 2400 PCR擴增儀(GE Healthcare Bio-Sciences公司)； 酶標儀(BioRad公司)；共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM780德國zeiss公司)。

1.3生物被膜形成能力檢測 采用微量滴定板法[11-12]，將糞腸球菌ace+、ace-菌液(1×107CFU/mL)，加入96孔細胞培養板中，每孔200 μL，37 ℃培養3 h～48 h，各時間點培養3孔，并設培養液陰性對照。吸去培養液，PBS緩沖液洗去浮游細菌，10%甲醛固定，結晶紫染色15 min，PBS緩沖液洗板，無水乙醇溶解結晶紫，測定各孔OD570值，每孔測3次取平均值。生物被膜形成力評價標準:測定陰性對照(培養液) OD570值，取陰性對照OD570平均值加3倍標準差為生物膜形成界定值Dc(D+3S)，測定的ace+、ace-糞腸球菌OD570值與Dc進行比較，未形成生物膜：OD570≤Dc；生物膜形成力弱：Dc4 Dc[13-14]。以生物膜形成力中等以上為生物膜陽性組。

1.4糞腸球菌ace基因檢測 應用 DNAMAN 軟件設計上下游引物，引物從5′至3′方向：

aceF: AAAGTAGAATTAGATCCACAC

aceR: TCTATCACATTCGGTTGCG

以腸球菌基因組DNA為模板，PCR擴增腸球菌ace基因；PCR反應程序為: 94 ℃ 5 min變性，(94 ℃ 30 s→56 ℃ 45 s→72 ℃ 60 s)×30個循環，72 ℃延伸7 min。擴增所得產物大小為290 bp。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，于凝膠分析系統中觀察。

1.5激光共聚焦顯微鏡比較ace+和ace-糞腸球菌生物被膜 于35 mm細胞培養皿內放入20 mm×20 mm滅菌玻片，將ATCC29212(ace+)、U8-ace-、EU8-ace-、ZU8-ace+菌液(5×106CFU/mL)1 mL分別滴至玻片表面，靜置1 min，加入BHI培養液1.5 mL，封口膜封閉，37 ℃分別培養6 h、12 h、18 h、24 h、48 h、72 h。棄培養液，用PBS沖洗浮游菌，于蓋玻片表面滴加100 μL AO/EB染液，暗室孵育染色15 min，PBS沖洗2次，吸水紙吸干，透明指甲油密封。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察收集圖像。CLSM觀察條件為：物鏡×20，氬激光514/488 nm。生物被膜標本由內(生物被膜與玻片相貼的面)向外(生物被膜的游離面)沿Z軸逐層掃描，獲得生物被膜的斷層掃描圖象。生物膜厚度取生物膜最外層和玻片之間的距離。生物膜的細菌密度取中間層斷層掃描圖象的數據進行分析。生物膜內細菌密度以CLSM斷層掃描圖象中的熒光量表示。

2 結 果

2.1糞腸球菌ace基因的擴增 對46株糞腸球菌臨床分離株進行PCR檢測ace基因，有28株檢測到ace基因，瓊脂糖凝膠電泳可見大小290 bp左右清晰條帶，與引物設計的預期結果一致，ace基因陰性株未見條帶，部分菌株電泳結果見圖1。

圖1 臨床分離糞腸球菌ace基因PCR產物Fig.1 PCR products of ace gene from clinical isolates of Enterococcus faecalis

2.2臨床分離糞腸球菌株生物膜陽性組與生物膜陰性組ace基因的檢出率比較 微量滴定板法對46株臨床分離糞腸球菌進行生物膜形成檢測65.22%(30株)為生物膜陽性菌株。生物膜陽性菌株中，23株(76.67%)菌株攜帶ace基因；生物膜陰性菌株中，5株(31.25%)菌株攜帶ace基因，經統計學分析，生物膜陽性、陰性菌株攜帶ace基因差別有統計學意義(χ2=9.04,P<0.05) (表1)。

2.3糞腸球菌ace+和ace-菌株生物被膜形成能力比較 微量滴定板法比較腸球菌野生株ATCC29212(ace+)、U8-ace-、空質粒對照株EU8-ace-、轉化株ZU8-ace+的生物被膜形成能力，各菌株的生物被膜形成能力隨培養時間延長而提高，糞腸球菌ATCC29212(ace+)以及轉化株ZU8-ace+在各時段的生物膜形成能力均比野生株U8-ace-強，經單因素方差分析，差異有統計學意義(F=5.32、6.13，P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差異無統計學意義(F=2.04，P>0.05)，圖2。

表1 生物膜陽性組與生物膜陰性組糞腸球菌ace基因的檢出率

Tab.1 Detection rate ofacegene ofE.faecalisin positive or negative biofilm group

ace+ace-合計ace陽性率/nnn%生物膜陽性2373076.67生物膜陰性5111631.25合計28184660.87

**與U8-ace-比較，P<0.01 *與U8-ace-比較，P>0.05圖2 糞腸球菌ace+、ace-菌株生物膜形成能力(OD570)Fig.2 Biofilm formation ability (OD570) of ace+, ace-E.faecalis

2.4糞腸球菌ace+和ace-菌株生物被膜厚度比較 激光共聚焦顯微鏡觀測比較糞腸球菌ace基因陽性、陰性菌株生物被膜厚度，在生物膜形成的各階段，ATCC29212(ace+)、轉化株ZU8-ace+所形成的生物膜的平均厚度比野生株U8-ace-的大，經單因素方差分析，差異有統計學意義(F=6.46、7.63，P<0.01)；空質粒對照株EU8-ace-與野生株U8-ace-比較，生物膜厚度差異無統計學意義(F=1.88，P>0.05)圖3。

**與U8-ace-比較，P<0.01 *與U8-ace-比較，P>0.05
圖3 糞腸球菌ace+、ace-菌株生物被膜在各階段的平均厚度
Fig.3 Average thickness oface+、ace-E.faecalisbiofilm at different stages

2.5糞腸球菌ace+和ace-菌株生物被膜細菌密度比較 激光共聚焦顯微鏡觀測，生物膜內層、中間層的細菌密度相對較大，而外層較低。取生物膜中層比較糞腸球菌ace+與ace-菌株所形成的生物膜的密度，結果表明，ATCC29212(ace+)、轉化株ZU8-ace+所形成的生物膜密度比野生株U8-ace-的高，經單因素方差分析，差異有統計學意義(F=8.83、10.32，P<0.01)；空質粒對照株EU8-ace-與野生株U8-ace-比較，生物膜密度無統計學差異(F=1.17，P>0.01)，圖4。

**與U8-ace-比較，P<0.01 *與U8-ace-比較，P>0.05圖4 ace+、ace-糞腸球菌生物被膜中層細菌密度Fig.4 Bacterial density of ace+、ace-E.faecalis biofilm at intermediate layer

3 討 論

細菌粘附是細菌感染宿主的起始步驟，在腸球菌毒力因子研究中，對粘附素的研究近年來較為廣泛。同時，細菌生物被膜在感染致病中的意義也越來越受重視。腸球菌生物被膜的形成在呼吸道感染、泌尿道感染尤其是留管相關泌尿道感染、感染性心內膜炎等醫院感染中都有具有重要意義。細菌粘附啟動感染以及細菌生物被膜形成都是細菌感染的關鍵步驟。

近年來，在粘附素啟動細菌感染第一步的基礎上，人們開始關注黏附素在生物被膜的形成中的作用。已有研究表明腸球菌表面蛋白esp、明膠酶gelE、糞腸球菌心內膜炎抗原EfaA、分選酶srt、腸球菌調節因子fsr和增強子結合蛋白ebpR等基因與腸球菌的生物膜形成相關[3-7]，腸球菌膠原結合蛋白黏附素是否有利于細菌生物被膜的形成未見報道。

本文對46株臨床分離糞腸球菌分別進行ace基因PCR檢測以及生物膜形成能力檢測。結果表明，46株臨床分離糞腸球菌中28株糞腸球菌攜帶ace基因，ace基因檢出率為60.87%，28株ace基因陽性組中，82.14%(23株)為生物膜陽性菌株，16株ace基因陰性組中僅有38.89%(7株)為生物膜陽性，ace基因陽性、陰性糞腸球菌生物膜形成情況的差別有統計學意義，P<0.05，初步表明該基因與生物膜形成具有相關性。

臨床分離菌株存在背景不一、多種毒力基因共存等情況，本文利用美國德克薩斯大學醫學院Barbara E. Murray教授饋贈的質粒pTEX5646(含pAT 392穿梭質粒，整段ace基因，壯觀霉素抗性)，構建了一對ace基因轉化變異株，通過微量滴定板法以及共聚焦顯微鏡觀察比較ace+、ace-糞腸球菌體外生物膜形成能力的差異。研究結果表明，共聚焦激光顯微鏡觀察，無論臨床菌株還是實驗室改造菌株，ace+糞腸球菌在不同階段所形成的生物膜的厚度、細菌密度均高于ace-菌株；微量滴定板法顯示，不同時間點ATCC29212(ace+)以及轉化株ZU8-ace+的生物膜形成能力的OD570值均大于野生株U8-ace-的OD570值，而ace-空質粒轉化對照株與ace-野生株比較，生物膜形成能力沒有統計學差別，提示糞腸球菌膠原黏附素ace基因有利于腸球菌體外生物被膜的形成。

細菌生物被膜的形成，需經歷初始表面粘附階段(可逆)；表面附著階段(不可逆，黏附素介導)；細胞間粘附聚集階段；發展和成熟階段等4個階段。雖然生物被膜的形成過程非常復雜，但初始粘附是細菌形成生物被膜的必要條件,因此黏附素至少在初始階段參與了細菌生物被膜的形成。在生物膜形成機制研究中，研究較多的是微生物表面成分識別粘附基質分子(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMMs)，這些細菌表面相關蛋白，能夠特異性地與宿主組織的細胞外基質(ECM)中的纖連蛋白(Fn) 、纖維蛋白原 (Fg)以及膠原等成分結合，介導細菌結合到宿主細胞。Philippe等報道，金黃色葡萄球菌纖維連接蛋白結合蛋白FnBPs主要參與金黃色葡萄球菌生物膜的形成的附著過程和聚集階段[9]。Court 等通過原子力顯微鏡技術證明FnBPs 通過多種低親和力鍵介導相鄰細菌間的粘附作用[10]。沙門氏菌Hap粘附素可以介導細胞間聚合，導致微小菌落及生物被膜形成[15]。腸球菌膠原結合蛋白Ace可介導糞腸球菌黏附到層粘連蛋白、膠原蛋白等細胞外基質蛋白，有助于粘附牙本質、腎細胞、膀胱癌等細胞，在導管相關泌尿道感染以及心內膜炎感染的動物模型中有毒力作用[16-18]。Ace與金黃色葡萄球菌膠原蛋白黏附素Cna同源，都屬于MSCRAMM家族，可在生物膜形成中發揮類似作用，具體深入機制有待進一步探討。

本文通過臨床菌株和實驗室構建菌株，研究比較糞腸球菌ace基因陽性、陰性菌株體外生物被膜的形成能力，為進一步的體內生物被膜動物模型研究提供相互印證，為尋找抑制腸球菌生物膜形成的途徑及腸球菌泌尿道、呼吸道等的醫院感染的防治提供新思路。

利益沖突：無

引用本文格式：強華，劉光英，林任璽.糞腸球菌ace陽性和陰性菌株體外生物被膜形成能力比較[J].中國人獸共患病學報，2019，35(7)：599-603. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.081