沙門氏菌CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型及變異研究

從20世紀(jì)80年代以來，在廣譜頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素(尤其是廣譜頭孢菌素)的選擇壓力下，催生了新型β-內(nèi)酰胺酶包括CTX-M、TEM、SHV、PER、VEB、BES、GES、TLA、SFO和OXA等，這類酶能夠降解并賦予對這些抗生素的耐藥性[1]。CTX-M以高度水解頭孢噻肟、輕度水解頭孢他啶為特征，水解活性可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等抑制[2]；迄今為止，已發(fā)現(xiàn)至少109種CTX-M型及相關(guān)變體[3]。前期的研究中，我們分析了S.enteritidis(ST11克隆)、S.indiana(ST17克隆)、S.thompson(ST319)等常見沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)這類菌的耐藥與CTX-M有相關(guān)性；同時發(fā)現(xiàn)了起源于禽的ST17超級耐藥克隆(ST17-XDR clone)，并預(yù)測ST319有可能是下一個超級耐藥克隆，CTX-M是這類超級耐藥克隆出現(xiàn)的主要原因[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒在CTX-M耐藥基因傳遞過程中有著重要作用[6]。通過對常見血清型腸炎沙門氏菌 (S.enteritidis)、印第安納沙門氏菌(S.indiana)、湯卜遜沙門氏菌(S.thompson) 等CTX-M分子基因型別、脈沖場凝膠電泳(PFGE)溯源分析及CTX-M氨基酸位點變異情況，研究CTX-M各型別流行特征及在超級耐藥克隆中的作用，為沙門氏菌耐藥及感染控制提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 研究采用江蘇及周圍地區(qū)2013-2016年間豬、雞基線調(diào)查、農(nóng)貿(mào)市場食品及食品從業(yè)人員、哨點監(jiān)測腹瀉病人及食物中毒病人收集S.enteritidis、S.indiana、S.thompson等主要血清型菌株共197株，在前期的研究中，完成CTX耐藥表型及相應(yīng)CTX耐藥基因的檢測，對頭孢噻肟耐藥且攜帶CTX-M基因共有61株[4-5]，包括S.indiana45株，S.enteritidis7株，S.thompson7株，鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)2株(表1)。

1.2 實驗方法

1.2.1CTX基因的分群試驗 參照已發(fā)表方法設(shè)計引物對CTX-M陽性株通過PCR試驗進(jìn)行分群試驗[7]。PCR產(chǎn)物通過商業(yè)測序公司進(jìn)行測序，序列通過與Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) (https://card.mcmaster.ca/analyze) 數(shù)據(jù)庫BLAST 注釋其CTX-M基因型。

1.2.2脈沖場凝膠電泳 參照中國細(xì)菌性傳染病分子分型實驗室監(jiān)測網(wǎng)絡(luò) Pulse Net China 的沙門氏菌 PFGE 分子分型方法，用 SeaKem glod agarose 將沙門氏菌包埋，用XbaI進(jìn)行酶切，把所得到的 DNA 片段用 Chefmapper 進(jìn)行脈沖場凝膠電泳分型，最后將成像結(jié)果用Bionu-merics7.6軟件聚類分析。

1.2.3基因測序 根據(jù)CTX-M分型及前期耐藥克隆研究結(jié)果[4-5]，選取9株S.indiana，2株S.thompson及1株S.enteritidis共12株進(jìn)行全基因測序分析。菌株利用TAKARA DNA提取試劑盒提取DNA，由商業(yè)測序公司使用PacBio○RRS II System進(jìn)行全基因組測序。序列拼接使用SPAdes-3.5.0軟件對預(yù)處理后的Illumina 數(shù)據(jù)和PacBio數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝。所得基因序列用相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫注釋其結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1CTX基因分型 61株CTX陽性的菌株分為3個亞群6個型。主要為CTX-M-9亞群(33株)，其次為CTX-M-1亞群(27株)。主要型別為CTX-M-65(29株)和CTX-M-55 (24株)。S.indiana攜帶這6種CTX-M基因型，主要為CTX-M-65及CTX-M-55基因型；S.thompson主要為CTX-M-65基因型；S.enteritidis主要為CTX-M-55基因型。 禽源分離株中檢測到5種CTX-M基因型，主要為為CTX-M-65及CTX-M-55基因型(表1)。

2.2PFGE分型結(jié)果 根據(jù)PFGE分子圖譜總體上分為4個基因簇 (cluster)，對應(yīng)相應(yīng)血清型。按照聚類分析70%相似度分類，可以將CTX-M陽性菌株分為19個型。A2，B4，B8，B9，D2等為主要型。A2主要是S.enteritidis攜帶CTX-M-55型； B4，B8，B9主要是S.indiana，主要攜帶CTX-M-55型和CTX-M-65型；D2為S.thompson，攜帶CTX-M-65型(圖1)。

表1 沙門氏菌不同血清型攜帶CTX-M分型結(jié)果

Tab.1 CTX-M genotypes in differentSalemonellaserotypes

血清型(No.)CTX-M群CTX-M型來源(No.)S.indiana(45)CTX-M-1群CTX-M-55禽源(14),人源(1),食源(1),豬源(2)CTX-M-79禽源(2),人源(1)CTX-M-9群CTX-M-14禽源(1),環(huán)境(1)CTX-M-27禽源(1)CTX-M-65禽源(20)CTX-M-64群CTX-M-123食源(1)S.enteritidis(7)CTX-M-1群CTX-M-55禽源(5),人源(1)CTX-M-9群CTX-M-65禽源(1)S.thompson(7)CTX-M-9群CTX-M-14食源(1)CTX-M-65禽源(6)S.typhimurium(2)CTX-M-9群CTX-M-65禽源(2)

圖1 61株CTX-M菌株P(guān)FGE聚類圖及CTX-M基因型別與血清型、來源間關(guān)系Fig.1 Dendrogram displaying PFGE genotypes with CTX-M genotypes, serotypes and the sources of 61 isolates

2.3CTX-M基因型的氨基酸突變位點 12株全基因測序中，包括本研究中全部6種CTX-M型，CTX-M-55，CTX-M-79， CTX-M-14，CTX-M-27，CTX-M-65， CTX-M-123；其中9株S.indiana中含全部6種CTX-M型；2株S.thompson及1株S.enteritidis均為CTX-M-55型。與已發(fā)表的CTX-M-1型(GenBank: AMM70777.1)、CTX-M-9型 (NCBI Reference Sequence: WP_032489926.1)和CTX-M-64型(NCBI Reference Sequence: WP_032492042.1)分別屬于CTX-M-1群、CTX-M-9群和CTX-M-64群的序列作為參照進(jìn)行比較。

經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)CTX-M-1、CTX-M-55和CTX-M-79，CTX-M-9、CTX-M-14、CTX-M-27和CTX-M-65，CTX-M-64和CTX-M-123均含有291個氨基酸。在CTX-M-1群中，易變化的主要是4個氨基酸位點：1，117，143，298。在CTX-M-9群中，易變化的主要是3個氨基酸位點：80，234，242。在CTX-M-64群中，易變化的主要是12個氨基酸位點：70， 86， 89， 90，91，92，97， 102， 103， 121， 230， 233。同一CTX-M基因群中，基因發(fā)生突變的氨基酸位點是固定的(表2)。

3 討 論

本研究中的CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶主要禽源出現(xiàn)，但在豬源、人源、食源以及環(huán)境均有涉及；出現(xiàn)了6個CTX-M基因型，主要為CTX-M-65和CTX-M-55。由于地域差異，不同地區(qū)出現(xiàn)的CTX-M的型別有所不同。國際上，澳洲、美國以CTX-M-15最為常見、拉丁美洲以CTX-M-2常見、歐洲西班牙以CTX-M-9和CTX-M-14常見[3，8-10]。 本文結(jié)果表明江蘇及周圍地區(qū)主要為CTX-M-65和CTX-M-55，與國內(nèi)動物分離株的研究報道的結(jié)果類似[11-13]。禽源ST17克隆中攜帶多種CTX-M基因，以CTX-M-55和CTX-M-65為主，且S.thompson則也攜帶CTX-M-14和CTX-M-65； CTX基因型復(fù)雜且多變可能是超級耐藥克隆形成并廣泛流行的原因之一。

表2 CTX-M群的CTX-M基因型氨基酸突變

Tab.2 CTX-M amino acid serial variation in different CTX-M groups

CTX-M群CTX-M分型氨基酸位點17080868990919297102103117121143230233234242275289CTX-M-1群CTX-M-1H——————————D—S—————NCTX-M-55M——————————N—A—————DCTX-M-79M——————————N—A—————NCTX-M-9群CTX-M-9——A—————————————AD—SCTX-M-14——A—————————————VD—SCTX-M-27——A—————————————VG—SCTX-M-65——V—————————————VD—RCTX-M-64群CTX-M-64—P—QTQKQPPA—T—AV————CTX-M-123—A—KSEPNRKS—S—TT————

注：H：組氨酸、D：天冬氨酸、S：絲氨酸、N：天冬酰胺、M：蛋氨酸、A：丙氨酸、V：纈氨酸、G：甘氨酸、R：精氨酸、P：脯氨酸、Q：谷氨酰胺、T：蘇氨酸、K：賴氨酸、E：谷氨酸；-：該位置的氨基酸相同

PFGE分子分型結(jié)果表明，CTX-M型別與血清型、地區(qū)來源及分子型密切相關(guān)。PFGE A2亞型中，是來自不同地區(qū)的S.enteritidis多數(shù)為CTX-M-55型；B4亞型中都是來源于同一地區(qū)ST17且都為CTX-M-55；最大的亞型B8中是來源于不同地區(qū)的ST17，CTX-M-65與CTX-M-55各半。D2亞型中都是來源于同一地區(qū)的ST319克隆的CTX-M-65。主要相同的分子型別中多數(shù)菌株為禽源，少數(shù)為人源，進(jìn)一步佐證動物源性耐藥基因是人源耐藥基因的主要來源[4-5]。PFGE分子分型表明，血清型、地區(qū)和來源是影響CTX-M基因型多樣性的重要因素。

根據(jù)全基因測序氨基酸比較結(jié)果顯示，CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶氨基酸位點易突變，且同群的變易氨基酸的位點是相同的，但群之間易變異氨基酸位點是不同的；CTX-M氨基酸位點多變且同群CTX-M基因型即使1位氨基酸位點突變就導(dǎo)致基因型別發(fā)生改變[2-3]。研究表明，CTX-M同群的菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥狀況基本相同，而不同群間的菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥差異較大[14-15]，氨基酸突變導(dǎo)致CTX-M基因型及對β-內(nèi)酰胺類抗生素抗藥性的變化。

CTX-M基因大部分位于質(zhì)粒上，不但可以進(jìn)行水平傳播還可以進(jìn)行垂直傳播[3，11]。位于質(zhì)粒上的CTX-M基因遺傳穩(wěn)定性差，上游具有固定插入序列ISEcp1，下游插入序列較多，常見的為IS903、IS26等，使得CTX-M基因可在沙門氏菌與腸桿菌科之間以及沙門氏菌與其它種屬細(xì)菌之間進(jìn)行快速的傳播，這是其水平傳播的關(guān)鍵因素[12-13]。國內(nèi)Wang W等及Wang J等分別報道了S.indianaST17克隆菌株C629及D90分別含有一個及多個攜帶有耐藥基因的質(zhì)粒。 其中pD90-1 (GenBank accession：CP022451) 攜帶CTX-M-65基因[16-17]。 本研究1株攜帶有CTX-M-27基因的典型ST17克隆菌株全基因測序(GenBank accession: CP031189，CP031190， CP031191)結(jié)果表明，該基因位于一小質(zhì)粒上(GenBank accession: CP031191)，其前后分子組成為： ISEcp1-blaCTX-M-27-IS903。以上結(jié)果表明，耐藥質(zhì)粒是超級耐藥克隆產(chǎn)生的主要原因。

利益沖突：無

引用本文格式：余菊，徐紅紅，申永秀，等.沙門氏菌CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型及變異研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35(7)：594-598. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.080