厚藤脫水素基因IpDHN啟動子IpDHN-Pro的克隆和調控轉錄活性分析

蘇華香,鄭潔旋,張會,何金實,簡曙光,夏快飛,陳建通,張美*

(1.中國科學院華南植物園，廣東省應用植物學重點實驗室，廣州 510650；2.中國科學院大學，北京 100049；3.海南大學熱帶農林學院,海口 570228)

厚藤(Ipomoea pes-caprae)是廣泛分布于熱帶亞熱帶濱海地區的多年生藤本鹽生植物，隸屬于旋花科(Convolvulaceae)番薯屬[1]。厚藤抗逆性強，對營養物質和水分的利用效率極高，具有良好的固沙能力和耐海水沖刷能力，在島礁防風固沙、綠化及生態重建等方面發揮重要作用[2]。厚藤作為優異的野生植物資源，具有較大的開發潛力及應用價值，同時也可作為一種研究植物抗逆分子機理、發掘抗逆基因的材料進行深入研究。

脫水素(dehydrin,DHN)是植物胚胎發育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)家族成員，該家族蛋白通常富含較高比例的親水性氨基酸，是一類高度穩定的親水性蛋白[3]。研究表明，LEA基因(包括脫水素基因)通常在植物組織遭遇缺水脅迫時廣泛誘導表達，在種子發育晚期的脫水過程中，以及植物組織遭受高鹽、干旱、冷凍基因ABA處理時表達上調[4]。脫水素可歸于LEA_II類蛋白[5]，目前已經鑒定的植物脫水素蛋白的分子量為9～200 kDa[6-7]，且通常含有1～3種具有不同重復的保守結構域。根據各個保守序列在蛋白中的分布數目，脫水素可分為Kn、SKn、KnS、YnKn和YnSKn(n表示重復數)[8]5個亞組。

有研究表明，當植物遭受能導致細胞脫水的相關逆境時，如高滲透壓或高鹽脅迫以及冷凍時，脫水素基因都能夠在細胞內大量表達[9]。脫水素基因針對逆境脅迫的轉錄調控是該類基因行使其正常的生物學功能的第一步，而基因的轉錄主要決定于其啟動子序列。脅迫誘導的基因啟動子通常含有多個/種脅迫調控的順式作用元件，包括ABA應答元件 ABRE(ABA-responsive elements)，C-重復 /干旱應答/低溫應答元件CRT/DRE/LTRE(C-repeat/drought-responsive/low-temperature-responsiveelement),轉錄因子MYB或MYC結合元件MYBPE/MYCPE(myeloblastosis/myelocytomatosispromoter elements)[8]。如黃瓜(Cucumis sativus)[9]、葡萄(Vitis vinifern)[10-11]、小麥(Triticum aestivum)[12]、大麥(Hordeum vulgare)[13]的脫水素基因啟動子中含有多個不同逆境脅迫應答元件，并且這些脫水素基因的表達均受到相應的脅迫環境的調控。綜上所述，基因的轉錄調控受啟動子區域的順式作用元件的影響，而鑒定具有特定逆境脅迫應答元件的啟動子在逆境脅迫的植物遺傳改良中具有重要的應用潛力。

本實驗室在前期研究中已經克隆了厚藤脫水素的cDNA序列，并根據其cDNA序列發掘出該基因對應的基因組序列。實時定量RT-PCR表明IpDHN是一個受脅迫誘導的耐鹽耐旱功能基因[14]。據此,本試驗擬通過染色體步移法克隆厚藤IpDHN基因的啟動子序列，分析啟動子中的順式作用元件，進一步構建IpDHN-Pro/pBI101.2植物表達載體，并轉化擬南芥植株，探討啟動子的表達模式，為啟動子序列應用于針對高鹽/干旱脅迫的植物轉基因育種和培養高鹽/干旱抗逆作物提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

厚藤(Ipomoea pes-caprae)的成年植株取材于中國科學院華南植物園溫室群(23°18′75.91″N,113°37′02.38″E)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態型為Col-0，栽培溫度25℃，相對濕度70%，光照強度為 120～150μmol m-2s-1，光暗周期為 16 h/8 h。大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α，植物表達載體pBI101.2和農桿菌株GV3101均為本實驗室保存。載體構建所需要的克隆載體pGEM T購于Promega(上海)公司，基因側翼序列擴增所用的試劑盒為Genome Walking Kit(TaKaRa Bio USA)。載體無縫克隆所用的In-Fusion HD Cloning Kit購于Clontech(TaKaRa Bio USA)公司。總RNA的提取依照 HiPure Plant RNA Kits(Magen)的說明書進行。cDNA鏈的合成依照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金公司)進行。qRTPCR反應參照 TransStart?Top Green qPCR Super-Mix(全式金公司)進行。其他試劑及儀器均為分子生物學實驗室常用試劑及設備。

1.2 方法

基因組DNA的提取取健康生長的厚藤小苗葉片0.1 g，放入研缽中加入液氮研磨至粉末，采用北京天恩澤基因科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒One-Tube Plant DNAOUT(貨號：60705)提取基因組DNA。采用電泳檢測和紫外分光光度計的方法檢測基因組DNA的純度和濃度，并用ddH2O將DNA的濃度調整至100 ngμL-1。

IpDHN基因組序列的獲取根據厚藤IpDHN的cDNA閱讀框序列，設計引物對DHNF和DHNR(5′-ATGGCGGAGGAGTGCCACC-3′和 5′-TTAATGGCATTCCCCACCCTT-3′)，以厚藤基因組DNA為模板，擴增IpDHN的基因組序列。PCR反應結束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從PCR產物中挑選明亮條帶，依照Magen公司HiPure Gel Pure DNAKits說明書進行瓊脂糖凝膠電泳回收，并連接于T載體上。將反應產物轉化大腸桿菌DH5α感受態菌株。挑取單克隆，提取質粒，送生物公司進行測序。

IpDHN基因5′側翼序列的克隆根據IpDHN基因的基因組序列，參照Genome Walking Kit的操作指南，設計兩個特異性引物SP1：5′-TCCTTATACTCCACCCCATG-3′和 SP2：5′-GCAGTGGGGCTTCTTCTCCT-3′。以厚藤基因組DNA為模板，用SP1、SP2對應染色體步移的第1、2輪隨機引物進行染色體步移克隆IpDHN基因5′側翼序列。兩輪PCR結束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從PCR產物中挑選明亮條帶，依照Magen公司HiPure Gel Pure DNAKits說明書進行瓊脂糖凝膠電泳回收，并連接于T載體上。將反應產物轉化大腸桿菌DH5α感受態菌株。挑取單克隆，提取質粒，送生物公司進行測序,并保存正確質粒(命名為IpDHN-Pro-pGEMT)備用。

生物信息學分析采用啟動子分析數據庫PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和植物順式作用元件分析數據庫PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)對IpDHN基因的5′側翼序列進行啟動子功能預測及順式作用元件進行分析。

IpDHN-Pro::GUS轉基因擬南芥的獲取以厚藤基因組DNA為模板，設計引物IpDHNProF：5′-CGACTCTAGAGGATCCCAGTGGGGCTTCTTCTCCT-3′和 IpDHNProR：5′-ACCTACCCGGGGATCCGCTCCTCCGCAGGCTTCTG-3′對厚藤脫水素基因IpDHN的啟動子序列進行PCR擴增(下劃線表示BamHI酶切位點)。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳回收；同時采用BamHI單酶切處理植物表達載體pBI101.2，回收線性化質粒。回收后IpDHNPRO啟動子PCR片段和線性化pBI101.2質粒經Nanodrop公司紫外分光光度計測定濃度，采用無縫克隆技術進行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反應產物轉化大腸桿菌DH5α感受態菌株。挑取單克隆，提取質粒，經測序鑒定為正確的陽性克隆后，命名為IpDHN-Pro/pBI101.2,保存質粒備用。經測序分析正確后，IpDHN-Pro/pBI101.2重組質粒采用凍融法轉入農桿菌GV3101中。以野生型擬南芥作為轉基因材料，采用花序侵染的方法，通過GV3101農桿菌介導轉化擬南芥。將所獲得的擬南芥轉基因T3代種子放于含有50μgmL-1卡那霉素的MS培養基上進行篩選。獲取T3代純合體擬南芥進行后續分析。

IpDHN-Pro的轉錄活性驗證取生長10 d的轉基因擬南芥T3代植株和開花擬南芥的不同部位,置于GUS染色反應液中處理3 h以上，采用組織化學法進行染色檢測，之后用95%的乙醇退色48 h后利用LEICADM2500體式顯微鏡拍照。配制1 mL的GUS染液可以按照以下操作進行，即取1.5mL的空離心管，首先加入309μL的ddH2O，再依次加入500μL 0.2 mol L-1的磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)，1μL 的 Triton X-100，10μL的50mmolL-1亞鐵氰化鉀溶液，10μL的50mmolL-1鐵氰化鉀溶液，20μL0.2molL-1的EDTANa2溶液(pH7.0)，100μL的甲醇，以及50μL10mgmL-1X-Gluc溶液(溶于二甲基甲酰胺)，并充分混勻。

IpDHN-Pro對脅迫和激素信號的響應取生長10 d的轉基因擬南芥T3代植株(MS培養基平板上)，分別加入200 mmol L-1NaCl、300 mmol L-1甘露醇和0.1 mmol L-1ABA進行高鹽、滲透壓和激素處理24 h，以ddH2O處理的幼苗為對照，取幼苗進行GUS組織化學染色并拍照。收集處理的擬南芥小苗各0.5 g提取總RNA，采用兩步法以總RNA為模板進行逆轉錄cDNA。根據羅氏熒光定量PCR LightCycler480使用方法進行Real time RT-PCR，檢測GUS基因的表達情況。GUS基因的引物為GUSRTF：5′-ACGGGGAAACTCAGCAAGC-3′和 GUSRTR：5′-TGAGCGTCGCAGAACATTACAT-3′。內參基因為擬南芥肌動蛋白基因AtACT2(At3g 18780)。AtACT2基因的引物為ACT2-RTF：5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′和 ACT2-RTR：5′-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3′。qRT-PCR 擴增程序為：95℃預變性30 s；95℃15 s，60℃35 s，40次循環，繪制溶解曲線。采用Excel 2003統計數據，樣本的Ct值取3次重復的平均值。

2 結果和分析

2.1 IpDHN啟動子IpDHN-Pro的克隆

根據厚藤IpDHN的cDNA序列，在起始密碼子和終止密碼子處設計引物，以基因組DNA為模板，PCR擴增獲得IpDHN序列片段。回收片段連接于T載體上測序，并和IpDHN的cDNA序列閱讀框進行比較，可知IpDHN序列中含有1個264bp的內含子序列(圖1)。

采用染色體步移法設計基因特異引物SP1和SP2,參考Genome Walking Kit說明書，以厚藤基因組DNA為模板，經兩輪PCR擴增獲得1條明亮的DNA條帶，大小約為1 kb(圖2)。

圖1 IpDHN基因序列。陰影部分為IpDHN基因的內含子；下劃線分別為引物SP2和SP1序列。Fig.1 Sequence of IpDHN.The sequence in gray is the intron,and the underlined sequences are primers SP2 and SP1.

圖2 IpDHN啟動子片段的PCR 擴增。1：標準DNA；2：第一輪PCR：3：第二輪PCR。Fig.2 PCR of IpDHN promoter.1：Standard DNA marker；2：The first PCR；3：The second PCR.

將該片段回收后連接于T載體上測序，即獲得長度為974 bp的IpDHN的5′側翼啟動子序列,將其輸入在線分析軟件PlantCARE和PLACE,該序列除了含有真核生物轉錄啟動核心元件TATA-box(TATA盒)和CAAT-box(CAAT盒)外，還存在一些其他的順式作用元件(圖3)。起始轉錄必需的TATA-box位于起止密碼子ATG上游178個堿基處(-178 bp)；而調控轉錄起始頻率的CAAT-box位于起止密碼子ATG上游140個堿基處(-140 bp)。在ATG上游48個堿基處(-48 bp)含有1個脫落酸應答元件(abscisic acid-response element；ABRE；TACGTG)；而在 ATG上游52、718和925個堿基處(-52、-718和-925 bp)還有3個Myb轉錄因子結合位點(myeloblastosisbinding sites,MBS1和 MBS2；CGGTCA 或 CAACTG)；ATG上游767個堿基處(-767 bp)含有植物防御反應相關的富含TC的重復序列(TC-rich repeat regulatory element；ATTTTCTCCA)。此外，在 ATG上游246個堿基處(-246 bp)含有一個種子胚乳特異表達的順式作用元件Skn-1基序(Skn-1 motif；GTCAT)。

2.2 啟動子IpDHN-Pro的起始轉錄活性

為探明IpDHN-Pro序列是否具有轉錄活性，將IpDHN-Pro連接至植物啟動子表達載體pBI101.2中，并通過農桿菌介導的擬南芥轉基因試驗，驗證其是否在擬南芥中具有啟動基因轉錄的活性。選取經卡那霉素篩選的T3代純合體轉基因擬南芥，分別對其根、莖、葉、花、莢果和幼苗進行GUS染色。結果表明(圖4)，GUS陽性信號在擬南芥的主根中最強，在蓮座葉的葉中也有一定的表達，而在幼苗的下胚軸中幾乎不表達；在成年植株葉片上有顯色，且表達量一般；在花序中有較低的表達，在發育角果的基部和頂端有較強的表達。這說明該啟動子可能屬于根、葉豐富的啟動子，在擬南芥中具備轉錄活性且正常生長條件下啟動轉錄活性較低。

圖3 啟動子IpDHN-Pro序列和順式作用元件Fig.3 Sequence of IpDHN-Pro and the cis-acting elements

圖4 轉IpDHN-Pro/pBI101.2擬南芥植株GUS組織染色。A：幼苗；B：真葉；C：主根；D：葉片；E：花序；F：角果。Fig.4 GUS staining of transgenic Arabidopsis with IpDHN-Pro/pBI101.2.A：Seedling；B：True leaves；C：Axial root；D：Leaf；E：Inflorescence；F：Silique.

2.3 啟動子IpDHN-Pro轉錄活性的影響因素

為進一步探索IpDHN-Pro的功能，對轉IpDHNPro/pBI101.2擬南芥進行高鹽、干旱、外源激素ABA等脅迫處理，然后進行GUS染色。在未經處理的對照擬南芥幼苗中，GUS陽性信號較弱,但經200mmolL-1NaCl、300mmolL-1甘露醇和 0.1mmolL-1ABA分別處理24 h后，擬南芥幼苗的GUS信號明顯增強(圖5)，這表明在高鹽、干旱和外源激素ABA處理下，IpDHN-Pro啟動轉錄的活性有所增強，造成葡萄糖苷酸酶GUS在植株體內活性增強。

為了證明GUS活性的增強是由于GUS基因的表達上調引起的，我們同時采用qRT-PCR方法分析了脅迫處理后的擬南芥幼苗GUS基因表達情況。在高鹽、高滲透壓和外源激素ABA處理下GUS基因的表達上調，且表達量分別上調了4、2和2倍(圖6)。這進一步證明，在啟動子IpDHN-Pro的控制下,GUS基因的表達受到了高鹽、干旱和外源激素ABA等脅迫的誘導，即我們所克隆獲得的厚藤脫水素IpDHN基因中974 bp的5′側翼序列為啟動子序列,具有起始轉錄的活性，且其調控GUS基因的轉錄受高鹽、干旱、外源激素ABA等脅迫的上調影響。

圖5 轉基因擬南芥幼苗在脅迫處理24 h后的GUS活性。A：對照；B：200 mmol L-1NaCl；C：300 mmol L-1 甘露醇；D：0.1 mmol L-1ABA。Fig.5 GUS activity in transgenic Arabidopsis seedlings under stress for 24 h.A：Control；B：200 mmol L-1NaCl；C：300 mmol L-1mannitol；D：0.1 mmol L-1ABA.

圖6 qRT-PCR分析轉基因擬南芥幼苗脅迫處理24 h后GUS基因的表達。1：對照；2：200 mmol L-1NaCl；3：300 mmol L-1 甘露醇；4：0.1 mmol L-1 ABA。**：P＜0.01。Fig.6 Expression of GUS in transgenic Arabidopsis seedlings under stress by qRT-PCR.1：Control；2：200 mmol L-1NaCl；3：300 mmol L-1mannitol；4：0.1 mmol L-1ABA.**：P＜0.01.

3 討論

脫水素基因是植物體內受鹽、干旱脅迫誘導的抗逆標志基因[3,8,15]，有大量研究證明該類基因與植物耐鹽、耐旱、抗凍等抗逆性密切相關[16]。高鹽和干旱是植物生長過程中最常見的逆境脅迫，通常會引起植物失水，造成細胞內水平衡失衡，進而影響植物的生長和發育。對于農作物而言，由于高鹽和干旱引起的農作物生長不良，進而造成農作物減產和品質下降是農業生產過程中的常見問題。因此,在植物基因工程育種中，通過上調一些抗逆基因的表達，提高植物或作物的抗逆性，是一種最為行之有效的方法。

啟動子是調控基因表達的主要因素，而啟動子序列所包含的順式作用元件通常能夠決定該基因的轉錄受哪些轉錄因子調控，并在何種情況下啟動轉錄或改變轉錄強度。我們的前期研究表明，厚藤IpDHN基因是一個典型的受鹽旱等非生物脅迫及ABA誘導的抗逆功能基因[14]，結合厚藤這一物種的極端耐鹽耐旱性，我們推測IpDHN基因的表達調控可能在厚藤抗逆性中發揮了重要作用。基于以上假設，本研究克隆并分析了IpDHN基因的啟動子序列，為深入了解厚藤的抗逆生物學特征奠定基礎，也為植物抗逆遺傳工程提供了可操作的遺傳物質基礎。

目前，鹽生植物已成為克隆耐鹽基因和鹽害誘導啟動子的主要來源[17]。厚藤是一種典型的熱帶亞熱帶鹽生植物，我們通過對厚藤IpDHN基因的啟動子區域(974 bp)進行鑒定，其含有多個與植物非生物逆境脅迫相關的順式作用元件，如ABRE、MBS以及富含TC的重復調控元件等。ABRE是ABA信號中關鍵的基因轉錄順式應答元件[18]，廣泛參與調控植物功能基因應答ABA信號及滲透壓脅迫[19-20]。MBS主要通過與轉錄因子MYB結合，而很多MYB轉錄因子均與植物應答干旱脅迫和ABA信號密切相關[21-22]。富含TC的重復調控元件主要參與調控植物防御反應和抗逆應答[23]，暗示了IpDHN基因的啟動子序列IpDHN-Pro具備廣泛抗逆應答特征。PlantCARE軟件預測結果表明，IpDHN-Pro序列還存在1個胚乳誘導表達元件Skn-1[24]，表明IpDHN基因能夠在種子發育后期胚乳發育中表達，符合IpDHN基因作為LEA基因家族成員這一基本特征。

本研究還成功獲得IpDHN-Pro調控GUS表達的轉基因擬南芥。通過對擬南芥不同組織部位的化學染色分析，IpDHN-Pro具有在擬南芥中廣泛調控基因表達的特征，但正常生長條件下，GUS表達水平較低，表明我們所克隆的IpDHN-Pro序列具備基本的起始基因轉錄功能，是一個有活性的啟動子；通過對轉基因擬南芥幼苗進行高鹽、滲透壓脅迫及ABA處理，轉基因擬南芥植株的GUS染色活性增強；同時qRT-PCR分析表明GUS的表達顯著增強。這表明IpDHN-Pro啟動子可驅動外源GUS基因受干旱或高鹽和外源激素ABA的誘導。同時，也驗證了前期對厚藤IpDHN基因表達研究的結論[14]。

本研究通過對克隆獲得的974 bp的IpDHN基因的5′側翼序列進行初步的生物信息學分析，鑒定出一部分可能的啟動子順式作用元件。通過轉基因和GUS組織化學染色研究，闡明了該啟動子序列具有起始基因轉錄的功能，證明IpDHN-Pro序列驅動GUS基因在擬南芥的不同組織中表達有差異,以下胚軸、主根和葉片中的表達較強，在角果中的表達微弱，而在花序中幾乎無表達，是1個根和葉豐富表達的啟動子；GUS染色試驗進一步證明該啟動子能夠在高鹽、干旱和外源激素ABA等脅迫下增強細胞內GUS活性；qRT-PCR分析表明IpDHN-Pro序列驅動的GUS基因的表達受高鹽、干旱和外源激素ABA誘導，均不同程度的上調表達。這為植物抗逆遺傳工程育種中利用特定脅迫誘導的啟動子調控植物抗逆性奠定理論基礎。