血小板對血管新生調節的研究進展

郭一凡(綜述) 樊 冰(審校)

(復旦大學附屬中山醫院心內科 上海 200032)

血管新生是一個動態、多階段的生理過程,需要多種協調活動,通過血管內皮細胞(endothelial cells,ECs)的增殖、遷移和分化,最終在原有血管的部位以出芽的形式形成新的微血管[1]。在正常成年人體內,血管新生受到精確調控,僅發生在胎盤血液循環的建立、卵巢周期中或傷口愈合的止血步驟之后[2]。生理條件下,血管新生只會在一段特定的時間內被激活(通常是幾天或幾周),隨后就會被抑制,而不適當的持續性血管新生往往與一系列疾病如腫瘤的生長和轉移、動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變等有關[3]。血小板調節血管新生的機制包括:(1)釋放多種促/抑血管新生蛋白:血小板α-致密顆粒中儲存大量調控血管新生的生長因子,血管新生激活蛋白包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)、基質細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor,SDF-1)等;血管新生抑制蛋白包括內皮抑素(endostatin)、血小板因子4(platelet factor,PF4)、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMPs)、纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor,PAI)、血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)等;肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)和轉化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)具有促進和抑制血管新生的雙重作用[3-4]。(2)釋放磷脂類信號分子:活化的血小板釋放出具有生物活性的磷脂分子,其中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)、磷脂酸(phosphatidic acid,PA)和磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)參與調節成血管反應中最關鍵的第二信使[3,5];(3)血小板微泡(platelet microvesicles,PMVs):又稱為血小板微顆粒(platelet microparticles,PMPs),是從活化的血小板上脫落的脂膜,具有與血小板類似的重要生物功能[6],在血管新生中發揮重要作用[7];(4)對ECs的作用:ECs是血小板釋放的多種細胞因子作用的靶細胞,來自血小板的成血管信號能誘導內皮細胞的表型改變,進而發生增殖和遷移。此外,血小板釋放產物(platelet releasates,PRs)還能增強ECs集落形成細胞(endothelial colony forming cells,ECFCs)的成血管作用[8]。此外,血小板微顆粒還能通過與ECs相互作用促進血管新生過程[9]。同時,ECs也能釋放一系列血管生成因子,對穩定血管壁有積極作用[10]。部分血小板釋放的促/抑血管新生分子見圖1。

HGF,TGF-β1 and S1P enhance both pro- and anti-angiogenic responses.D:Dense granule,L:Lysosome.

圖1 由α-顆粒釋放的促/抑血管新生分子
Fig 1 Pro- and anti-angiogenic factors released by α-granule

血小板顆粒血小板內含有的顆粒主要有3類:α-顆粒、致密體和溶酶體,其中α-顆粒為血小板內含量最多,內容最豐富的顆粒[11]。蛋白質組學研究表明α-顆粒能釋放上百種可溶性分子,參與包括凝血、炎癥反應、動脈粥樣硬化形成、傷口愈合和血管新生在內的一系列生理及病理過程。在這些分子中,研究最多的是促進血管新生的VEGF和抑制血管新生的內皮抑素。這些不同的血管新生調節因子被包裝在形態不同的α-顆粒中,當不同的蛋白酶激活受體(protease activated receptors,PARs)被激活時,有選擇性地被釋放。PAR-1被激活時釋放VEGF,PAR-4被激活時釋放內皮抑素[12-14]。與之相似的是,有研究報道堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和TSP-1同樣被分裝在不同的α-顆粒內[12]。另一些研究提出了不同的結論。Kamysowski等[15]在高分辨率熒光顯微鏡下雖然未觀察到不同亞型的α-顆粒,但觀察到細胞因子在α-顆粒內存在特定的空間分布,van Nispen等[16]也觀察到相似的結果。Etulain等[17]用不同的蛋白酶激活受體激動蛋白(PAR-activator protein,PAR-AP)分別激活PAR-1和PAR-4,觀察人血小板產生VEGF和內皮抑素的總體效應,發現循環中的內皮抑素維持抑制血管新生的穩定狀態,而在PAR-1與PAR-4激活后,α-顆粒通過分泌VEGF促進血管新生。Jonnalagadda等[18]則發現血小板分泌細胞因子的總量和速率受激活劑強度的影響,但不會因激動劑種類不同而對血管產生不同的效應,側面支持了Etulain等[17]的結論。這些矛盾的研究結果表明,雖然血小板對血管新生的總體效應是促進的,但現階段對α-顆粒釋放產物調節機制的認識還很有限,需要進一步對控制α-顆粒分泌的生物化學過程及其產物的蛋白質組學進行研究。闡明α-顆粒分泌細胞因子的機制有助于理解血小板在多種生理和病理狀態下對血管新生的調節作用,從而為調控該生物學過程的新藥研發提供設計思路。α-顆粒對血管新生的總體促進效應也提示,抗血小板治療可能在與血管新生異常有關的疾病中起保護作用。

除α-顆粒外,King等[19]通過對載脂蛋白E(ApoE)和HSP3基因缺陷小鼠的研究發現,在HSP3基因缺陷導致致密顆粒分泌缺乏的小鼠模型中,動脈血栓形成、炎癥反應和內膜增生程度均高于對照組小鼠。因此,血小板致密顆粒分泌缺乏對冠狀動脈粥樣硬化的發生具有保護作用,提示致密顆粒中的分泌物對血管重建有調控作用,但其對血管重塑的影響是否獨立于促血栓和促炎作用還有待進一步研究。

血小板磷脂血小板磷脂是由α-致密顆粒釋放的信號分子[20],也被稱為磷脂生長因子(phospholipid growth factor,PGF),其化學本質為磷脂而非蛋白。在活化的血小板所釋放多種生物活性磷脂分子中,LPA、PA和S1P與血管新生反應關系最密切。在哺乳動物體內,磷脂類信號分子的受體主要是內皮細胞分化基因(endothelial cell differentiation gene,EDG)受體,該受體是一類G蛋白耦聯受體,在組織和細胞中廣泛分布,對細胞的生長、發育、穩定和細胞骨架構建具有重要作用[21-22]。在所有磷酯類信號分子中,S1P的研究最為廣泛,它是由鞘氨醇經過鞘氨醇激酶(SphK1和SphK2)磷酸化后形成的生物活性分子[23]。S1P對包括維持動脈緊張度、血管新生、神經發生和內皮細胞屏障穩定在內的多種血管生理過程具有調控作用[24-27],被認為是一種具有促血管新生作用的信號分子。S1P受體屬于G蛋白耦聯受體超家族,已知有S1P1～S1P5 5種類型[28]。隨著對S1P受體和信號通路的逐步認識,發現S1P對血管新生的調節具有雙重性,并非單一的促進作用。Gaengel等[29]發現,S1P與S1P1結合后,能夠抑制VEGFR2信號通路,提高VE-鈣黏素在內皮細胞連接間的穩定性,從而抑制內皮細胞增殖。Ben等[30]也證實在血管形成的過程中,S1P1具有維持新生血管正常形態,并負性調節出芽式血管新生。Mascall等[31]通過對ECs、平滑肌細胞和成纖維細胞的共同培養,發現S1P還能通過S1P2受體激活ROCK通路,促進平滑肌細胞釋放TIMP2,發揮抑制血管新生的作用。Mousseau等[32]的研究也得出了相似結論,提示S1P對血管新生的調節作用很可能與細胞表達的S1P受體類型和組織微環境有關。在心肌梗死后,血管新生對挽救心肌細胞、恢復心臟功能具有重大意義,目前以心功能重建為目的的心肌干細胞移植面臨著由于血管新生不良等因素導致的心肌干細胞成活與分化率低的嚴峻問題[33]。S1P作為能同時與ECs和平滑肌細胞發生聯系的信號分子,對其調節血管新生機制的深入研究,可能為心肌梗死后心臟功能重建提供新的作用靶點和治療思路。

PMPsPMPs是從活化的血小板上脫落的一小塊脂膜,直徑通常為0.1～1 μm。Kim等[7]在體外人臍靜脈ECs培養中首次發現PMPs能促進ECs的增殖和存活,該研究還表明PMPs對血管發育的作用是通過VEGF、FGF-2以及磷脂成分(如S1P)共同完成的。PMPs對血管新生的調控作用正在逐漸被認識。Brill等[34]對大鼠心肌缺血模型的研究也證實PMPs能通過釋放VEGF促進血管新生。此外,Hayon等[35]在大鼠腦缺血模型中證實PMPs具有劑量依賴的促進血管和神經組織新生的作用,該結果同時被另一項由Shan等[36]完成的關于PMPs對抗腦缺血再灌注損傷的研究所支持。Mause等[37]發現,PMPs還可以與具有成血管作用的早期內皮祖細胞(early outgrowth cells,EOCs)發生生物膜的同化與合并,從而促進EOCs的表面抗原向ECs轉換,并誘導EOCs的分泌蛋白質組向促進ECs增殖、遷移及成毛細血管的方向轉化。與該研究相符合的是,用動脈粥樣硬化患者外周血中分離得到的PMPs預處理血液循環中的成血管細胞后,可以促進下肢缺血大鼠體內的血管新生,該促血管新生效應依賴于PMPs釋放的正常T淋巴細胞表達和分泌的活性調節蛋白[38]。一系列研究提示PMPs具有重要的臨床意義,在與異常血管新生相關疾病的臨床應用中或許可以作為預后因子或新的治療靶點。PMPs調節血管新生的主要機制如圖2所示。

PMPs release different pro-angiogenesis cytokines such as VEGF,PDGF,bFGF,S1P to induce EC proliferation,migration and differentiation.In addition,PMPs upregulate the expression of membrane receptors on EOC,which induces EOC differentiation to EC,and release pro-angiogenesis molecules including VEGF,EGF,HGF,GM-CSF,etc.

圖2 PMP作用于EOC及EC調節血管新生
Fig 2 PMP regulates angiogenesis by exerting influences on EOC and EC

血小板源產物的臨床應用雖然血小板促進血管新生的具體機制尚未完全闡明,但其臨床應用前景已受到廣泛重視。已有研究嘗試利用血小板凝膠、富血小板血漿、血小板裂解產物等血小板源產物促進體表創傷的愈合[39]、修復心梗后的心肌組織[40-41]、保護缺血性心肌病中遭受缺血再灌注損傷的心肌[41-42]、減輕缺血性腦卒中對局部腦神經組織的損傷[43]。Cheng等[40]利用免疫染色和微血管造影的方法在大鼠體內證實,血小板凝膠具有促進毛細血管新生、保護心梗后損傷心肌的作用,同時還發現在此過程中一些具有促血管新生作用的基因(如HGF,bFGF)被上調了。該研究認為血小板凝膠的促血管新生作用與其提供的物理支架環境與血小板分泌的各類可溶性成分有關。血小板促血管新生的作用在缺血導致的表皮損傷中也引起了重視,Anitua等[44]嘗試通過皮下注射富含生長因子的血小板濃縮液,治療后肢缺血模型小鼠的表皮損傷,在注射后對小鼠后肢進行正電子斷層掃描及免疫組化分析后發現,血小板濃縮液可以顯著促進血管新生,增加缺血部位的血流灌注,加速肌肉修復,并促進缺血部位傷口的愈合。

對血小板促血管新生作用的認識拓寬了臨床中對下肢缺血損傷或糖尿病足部潰瘍的治療手段,也為心梗后心肌組織的修復,心功能的重建帶來啟發。富血小板血漿制成的凝膠已經在下肢缺血性病變和糖尿病足部潰瘍的患者中得到應用并取得了良好效果,可以有效加速血管新生,促進創傷愈合,具有良好的生物相容性、無毒、治療花費低廉等優點,具有廣闊的臨床應用前景[45-46]。

結語隨著越來越多的分子機制和信號通路被發現,提示血小板對血管新生的調節處于精確而嚴密的信號網絡之中,使機體在需要時促進血管新生,并在恰當的時候抑制血管異常增殖,同時保證新生血管形態規則完整,維持功能穩定。血管新生在多種生理或疾病中的關鍵地位決定了對血小板調節血管新生研究的重要臨床意義,不僅能為疾病的精準治療提供可能靶點,也可能作為某類疾病的預測、診斷、評價或預后因子,有助于正確認識抗血小板治療以及血小板成分輸血治療在相關領域的應用。對血小板調控血管新生認識的加深可為臨床中以缺血為主要病理基礎的疾病,如心肌梗死、缺血性腦卒中、下肢缺血性疾病、糖尿病足部潰瘍等提供了新的治療思路,從而優化治療策略,解決相應的臨床問題。