脂多糖(LPS)對小鼠Raw 264.7細胞Irak1bp1表達的影響

談志麗 王迎迎 何 玉 鐘 歡 施青青 楊 雪 徐國榮 劉亮明

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院感染科 上海 201600)

巨噬細胞是體內(nèi)重要的免疫細胞之一,在機體免疫炎癥反應中發(fā)揮重要的作用,其表面的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)如Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)可被外來病原體或內(nèi)毒素激活,啟動炎癥信號通路,促進促炎細胞因子的表達與分泌[如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6和IL-1β等],產(chǎn)生損傷性炎癥反應[1]。IL-1受體相關(guān)激酶1結(jié)合蛋白1(IL-1 receptor associated kinase 1 binding protein 1,Irak1bp1)的編碼基因位于6q14.1,全長79 356 bp[2],是Irak1蛋白質(zhì)的結(jié)合蛋白。Irak1蛋白質(zhì)在TLR4介導的MyD88依賴的信號通路中,被接頭蛋白MyD88磷酸化后激活TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)并使之泛素化,泛素化的TRAF6分子招募轉(zhuǎn)化生長因子-β活化激酶 1(TGF-β activated kinase-1,TAK1),TAK1 能夠磷酸化激活I(lǐng)kB蛋白激酶(IkB kinase,IKK),進而促進NF-κB釋放入核,激活NF-κB炎癥通路[3]。目前研究表明Irak1bp1蛋白質(zhì)與炎癥關(guān)系密切,但是對于炎癥反應的具體調(diào)控作用及調(diào)控機制仍存在不同的觀點[4-5],Conner等[6]研究發(fā)現(xiàn)Irak1bp1能夠抑制IL-6分泌而促進IL-10分泌,發(fā)揮抑炎作用;而Benson等[7]卻發(fā)現(xiàn)Irak1bp1能夠促進IL-6及IL-8分泌。為進一步了解Irak1bp1蛋白質(zhì)與炎癥反應的關(guān)系,本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠Raw 264.7細胞,研究核內(nèi)外Irak1bp1蛋白質(zhì)的表達情況。

材 料 和 方 法

主要試劑和材料單核細胞系Raw 264.7細胞購自中國科學院上海細胞庫;胎牛血清購自美國Gibco公司;LPS購自美國Sigma公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;PCR相關(guān)試劑購自日本Takara公司;ELISA相關(guān)試劑購自美國Ebioscience公司;Western blot相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Irak1bp1兔多克隆抗體購自美國Abcam公司;β-actin及Lamin B1兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司。

細胞培養(yǎng)采用RPMI 1640細胞培養(yǎng)基(含90% RPMI 1640培養(yǎng)液、10% FBS和100 U/mL青鏈霉素混合液),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠Raw 264.7細胞。采用錐蟲藍染色檢測細胞活力。

細胞分組和處理細胞接種于6孔板,每孔細胞數(shù)為5×105個。培養(yǎng)24 h待其穩(wěn)定貼壁后,將細胞隨機分成2組:A組為正常對照組,B組為LPS刺激組。LPS以RPMI 1640培養(yǎng)液配置,終濃度為20 μg/mL,劑量及用法見參考文獻[8],于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。LPS刺激6 h后分別收集細胞和上清液用于后續(xù)實驗,實驗重復6次。

總RNA的提取和質(zhì)量檢測采用Trizol試劑提取總RNA,具體操作按照說明書進行。采用吸光度比值(D260/280)及瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度及完整性:純度良好(1.8～2.0)、RNA條帶完整(28S和18S條帶明亮清晰,28S的亮度是18S的2倍以上)者進行下一步實驗。

逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR取1 μg RNA作為模板用于第一鏈cDNA的合成,具體流程按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。引物的設計與合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成,目的基因和內(nèi)參引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應體系(20 μL):2×SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)10 μL、上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、50×ROX參比染料Ⅱ 0.4 μL、DNA 模板2 μL、dH2O(滅菌蒸餾水) 6.8 μL。采用兩步法進行擴增,第1步:95 ℃、30 s,1個循環(huán);第2步:95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT方法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

表1 基因擴增引物序列和產(chǎn)物長度Tab 1 Primer sequences and product length of gene amplication

ELISA檢測采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測細胞上清液中 IL-6的水平,按照試劑盒說明書進行操作。每份標本設2個復孔,取均值。實驗重復6 次。

Western blot檢測按照Western blot及IP裂解液說明書進行總蛋白提取,漿蛋白及核蛋白提取按照碧云天核蛋白和漿蛋白抽提試劑盒說明書進行。采用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度,變性、分裝后于-70 ℃凍存。取30 μg總蛋白、漿蛋白及核蛋白進行10 % SDS-PAGE,電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜,室溫牛奶封閉2 h,兔抗鼠一抗(1∶1 000稀釋) 4 ℃過夜,TBST漂洗,加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗,室溫反應1 h。 漂洗后置于顯色液中顯色,通過伯樂分子成像系統(tǒng)成像并觀察,采用image J軟件進行灰度值分析。

結(jié) 果

LPS促進Raw 264.7細胞IL-6 mRNA表達A、B組Raw 264.7細胞IL-6 mRNA相對水平分別為1.00±0.06(n=6)和8.13±0.50(n=6),B組較A組顯著升高(P<0.01,圖1),提示LPS促進Raw 264.7細胞IL-6 mRNA的表達。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖1 LPS刺激的Raw 264.7細胞IL-6 mRNA相對水平
Fig 1 Relative level of IL-6 mRNA in Raw 264.7cells stimulated by LPS

LPS促進Raw 264.7細胞IL-6 蛋白質(zhì)表達B組IL-6 蛋白質(zhì)相對水平較A組顯著升高(444.89±103.43vs.162.08±51.78,P<0.01),提示LPS能夠促進Raw 264.7細胞IL-6 蛋白質(zhì)表達(圖2)。

LPS促進Raw 264.7細胞Irak1bp1 mRNA表達B組Irak1bp1 mRNA 相對水平較A組升高(1.21±0.10vs.1.00±0.06,P<0.01),提示LPS促進Raw 264.7細胞Irak1bp1 mRNA的表達(圖3)。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖2 LPS刺激的Raw 264.7細胞上清IL-6蛋白質(zhì)相對水平
Fig 2 Relative level of IL-6 protein in the supernatant ofRaw 264.7 cells stimulated by LPS

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖3 LPS刺激的Raw 264.7細胞Irak1bp1 mRNA相對水平
Fig 3 Relatvie level of Irak1bp1 mRNA in Raw 264.7cells stimulated by LPS

LPS促進Raw 264.7細胞Irak1bp1蛋白質(zhì)表達B組Irak1bp1總蛋白水平較A組顯著增高(1.36±0.20vs.1.00±0.00,P<0.05),提示LPS促進Raw 264.7細胞Irak1bp1總蛋白的表達(圖4)。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖4 LPS刺激的Raw 264.7細胞Irak1bp1總蛋白相對水平
Fig 4 Relative level of total Irak1bp1 protein inRaw 264.7 cells stimulated by LPS

LPS單獨處理不影響胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達B組Raw 264.7細胞胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)相對水平與A組相比差異無統(tǒng)計學意義(1.12±0.27vs.1.00±0.00),提示 LPS單獨處理并不影響胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達(圖5)。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖5 LPS刺激的Raw 264.7細胞胞質(zhì)Irak1bp1
蛋白質(zhì)相對水平
Fig 5 The relative level of cytoplasmic Irak1bp1 protein inRaw 264.7 cells stimulated by LPS

LPS促進核內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達B組Raw 264.7細胞Irak1bp1漿蛋白相對表達水平較A組顯著增高(1.61±0.45vs.1.00±0.00,P<0.01),提示LPS促進核內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達(圖6)。

FigA:Western blot result;Fig B:Relative expression level.A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖6 LPS 刺激的Raw 264.7細胞胞核內(nèi)Irak1bp1
蛋白質(zhì)相對水平
Fig 6 The relative level of nuclear Irak1bp1 protein inRaw 264.7 cells stimulated by LPS

討 論

作為重要的免疫細胞之一,巨噬細胞可以依靠其表面的CD14分子和TLR被LPS激活,進而啟動MyD88依賴和TRIF依賴的信號通路[9],誘導促炎因子釋放[10],在急性肝衰竭[11-12]、急性胰腺炎[13]等多種免疫損傷性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

Irak1bp1是Irak1蛋白質(zhì)的結(jié)合蛋白,目前對于其功能的研究十分缺乏,僅有的研究顯示Irak1bp1與炎癥關(guān)系密切,但是對于炎癥反應的具體調(diào)控作用及機制仍存在不同的觀點[4-5]。Harrington團隊研究發(fā)現(xiàn)Irak1bp1能夠促進炎癥反應,過表達Irak1bp1能夠促進IL-6及IL-8的分泌,而且能夠增強TNF-α誘導的NF-κB激活[5,7]。進一步研究發(fā)現(xiàn),Irak1bp1功能發(fā)揮可經(jīng)歷以下步驟:(1)磷酸化 Irak1bp1是Irak1蛋白的結(jié)合蛋白,也是Irak1的磷酸化底物[14],在TNF-α誘導的NF-κB激活過程中,Irak1首先被TNF-α作用而磷酸化[15],繼而磷酸化Irak1bp1并促使其入核[14]。Irak1催化活性缺失可抑制Irak1bp1入核,也能阻斷TNF-α誘導的NF-κB的激活[14],Irak1bp1的磷酸化是其功能發(fā)揮的首要步驟。(2)核轉(zhuǎn)位Irak1bp1序列中存在與p65、p50等入核基因相似的核定位序列,Irak1bp1磷酸化后進入細胞核,能夠增強NF-κB p65亞基的轉(zhuǎn)錄激活能力,核定位序列缺失將削弱上述作用[16],核轉(zhuǎn)位是Irak1bp1功能發(fā)揮的基礎。(3) p65/MED1/Irak1bp1復合體形成:MED1是核受體協(xié)同刺激因子,p65/MED1/Irak1bp1復合體的形成有助于p65轉(zhuǎn)錄激活作用的增強[17]。然而,Conner團隊卻有不同的發(fā)現(xiàn),Irak1bp1在缺失核定位序列時仍然能夠調(diào)控炎癥反應,并且主要起抑制炎癥的作用,Irak1bp1在胞質(zhì)中與p105結(jié)合,通過某種途徑(目前尚不明確)促使NF-κB抑制性亞基p50/p50入核比例增高[4],p50及其前體蛋白p105又稱NF-κB1,屬于NF-кB家族成員,具有DNA結(jié)合的能力,但無基因轉(zhuǎn)錄激活能力[18-19]。p50/p50入核增多,與P65/P50競爭炎癥因子結(jié)合位點,進而抑制IL-6分泌及其抑炎作用[4]。

為進一步了解Irak1bp1蛋白質(zhì)與炎癥反應的關(guān)系,本研究采用LPS刺激Raw 264.7細胞,并研究Irak1bp1的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激誘導Raw 264.7細胞IL-6 mRNA及蛋白質(zhì)表達的同時促進Irak1bp1 mRNA的表達,通過Western blot也發(fā)現(xiàn)LPS刺激促進Raw 264.7細胞分泌Irak1bp1蛋白質(zhì),提示Irak1bp1蛋白質(zhì)與TLR介導的炎癥反應關(guān)系密切,這與Conner等[6]的研究結(jié)果一致。進一步研究顯示LPS主要使核內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)水平增加,而對胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)水平?jīng)]有影響,提示LPS能夠促進Irak1bp1進入細胞核,多項研究顯示LPS能夠通過激活TLR4-MyD88信號通路激活I(lǐng)RAK1蛋白質(zhì)[3],這與既往研究結(jié)果類似[14-16],即IRAK1磷酸化Irak1bp1蛋白質(zhì)入核并發(fā)揮作用。Irak1bp1對于炎癥反應具體的調(diào)控作用目前仍不明確,不同研究團隊得出的不同觀點可能與其研究對象不同、刺激因素及研究的側(cè)重點不同有關(guān),Irak1bp1的炎癥調(diào)控作用及調(diào)控機制仍然需要進一步研究。