新疆石河子地區綿羊源胰闊盤吸蟲的分離及分子鑒定

王正榮 ，張艷艷 ，徐雪萍 ，楊華 ，薄新文 *

（1.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，新疆 石河子 832000；

2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000）

胰闊盤吸蟲是一種常寄生于水牛、駱駝、綿羊和山羊胰管，偶爾也寄生于膽管的一種吸蟲，該蟲種是寄生于反芻動物的優勢闊盤屬吸蟲。胰闊盤吸蟲的長期寄生會導致宿主胰管肥大，上皮增生，以及胰管周圍組織的纖維化，進而引起胰闊盤吸蟲病[1]。該病在世界上很多國家均有報道，雖然已經過多年的防控，但該病在一些地區的感染率依然較高，可達到47%-55%[2]。研究報道稱胰闊盤吸蟲的致病性相對較弱，但胰闊盤吸蟲可能引起被感染動物生產性能的下降，包括體重減輕，產肉性能下降，以及最終導致死亡[3]。也有一些研究報道顯示，由于某些特定群體的飲食習慣，胰闊盤吸蟲偶爾也會感染人[4-5]。目前還沒有商品化的用于預防胰闊盤吸蟲病的疫苗，對該病主要采取藥物防治方法，常用藥物有吡喹酮或三氯苯咪唑等[6]。

新疆是畜牧業大省，牛羊養殖數量較大，且養殖方式呈現多樣化，包括放牧、半舍飼和全舍飼等。在這種多種養殖模式并存的現狀下，其寄生蟲感染，尤其是胰闊盤吸蟲感染情況如何，相關文獻較少。因此，為了解筆者所在石河子地區綿羊胰闊盤吸蟲的感染現狀，我們采用常規形態學鑒定以及PCR聚合酶鏈反應分子鑒定方法，于2014年2月-2015年1月在石河子開展羊胰闊盤吸蟲流行病學調查，調查結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗羊47只，其中42只來自石河子143團某個體羊場，3只來自石河子活畜市場，2只來自石河子141團。試驗羊中有35只母羊，均為新疆軍墾細毛羊雜交羊，12只公羊，2只為本地大尾羊，其余為本地土種羊與新疆軍墾細毛羊雜交羊，2～5歲不等，冬季圈養，夏季在天山深處夏牧場放牧，春、秋兩季在本地山間牧場放牧，于2014年3月25日前后，例行春季驅蟲，所用藥物為阿維菌素注射液，0.2 mg/kg體重。

1.2 試驗方法

連續12個月，每月剖檢綿羊3～4只。胰臟用剪刀沿胰管剪開，放水中漂洗，檢查并挑出蟲體，鑒定蟲種。

1.3 胰闊盤吸蟲的PCR鑒定

用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒（康為世紀公司）提取蟲體DNA，然后用于擴增闊盤屬吸蟲18S rRNA部分基因的PCR分析[7]；所有的PCR分析均包括陽性對照，同時采用高壓滅菌去離子水為模板作為陰性對照。PCR 擴增條件如下：94°C預變性5 min，94°C變性35 s，55°C復性45 S，72°C延伸2 min，35個循環，72°C延伸10 min，所有PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色，紫外燈下檢測。擴增引物如下，上游引物：5'-GGCTCATTAAATCAGCTATGGTT-3'，下游引物：5'-ACGACTTTTACTTCCTCTAAAT-3'。

1.4 數據處理

PCR擴增產物采用康為世紀公司快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化，純化產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。采用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）軟件將測序獲得基因序列與genbank中的類似序列進行比較。然后，利用Mega 6.0軟件構建以18S rRNA基因為基礎的系統發育樹，系統進化樹的構建采用 neighbor-joining法，bootstrapped的值為1000，同時以大片吸蟲18S rRNA基因作為進化樹的外組。

2 結 果

2.1 胰闊盤吸蟲的感染情況

被檢的47只羊中有6只檢出胰闊盤吸蟲，感染率為12.77%，感染羊中僅一只羊感染強度較高，達300條，另外幾只羊感染強度不高，分別感染1～25條不等。少量感染時胰臟未見明顯病變。大量感染時，胰臟腫大，外觀呈黑色條索狀扭曲，質地變硬，胰管內壁充血、出血、增厚，周圍腸系膜淋巴結腫脹，呈黑豆狀，感染羊極度虛弱消瘦。

2.2 胰闊盤吸蟲成蟲形態學鑒定

活的胰闊盤吸蟲為棕紅色，固定后為灰白色。蟲體扁平，較厚，呈長卵圓形，吸盤發達，口吸盤較腹吸盤大。咽小，食道短，腸支簡單。睪丸2個，圓形或略分葉，左右排列在腹吸盤后。雄精囊呈長管狀，位于腹吸盤前方與腸支之間。生殖孔開口于腸叉的后方。卵巢分葉3～6瓣，位于睪丸之后，體中線附近，受精囊成圓形，在卵巢附近。子宮彎曲，內充滿棕色蟲卵，位于蟲體的后半部。卵黃腺呈顆粒狀，位于蟲體中部兩側，見圖1。我們選取每只羊來源的蟲體各一個，共計6個蟲體，對其大小進行了測量，結果顯示其大小為8.0～16 mm×5.0～5.8 mm。

圖1 胰闊盤吸蟲的蟲體壓片以及伊紅染色圖片

2.3 胰闊盤吸蟲的PCR鑒定

本試驗對采集的18個蟲體進行了PCR擴增以及瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，擴增片段的大小為528 bp左右，與預期大小一致，見圖2。

圖2 18個胰闊盤吸蟲的PCR擴增以及瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.3 基于18S RNA部分序列的遺傳進化分析（圖3）

圖3 石河子胰闊盤吸蟲分離株遺傳進化分析

本研究采用PCR方法擴增了18個吸蟲的18S RNA基因的部分序列，最終選取其中6個蟲體的18S RNA基因擴增序列進行測序及遺傳進化分析，石河子分離蟲株依次命名為SHZ-1，SHZ-2，SHZ-3，SHZ-4，SHZ-5以及 SHZ-6。同時我們以 Genbank數據庫中的胰闊盤吸蟲 （Eurytrema pancreaticum，NO.DQ401034.1）、 腔闊盤吸蟲 （Eurytrema coelmaticum，NO.DQ401035.1）、 枝岐腔吸蟲（Dicrocoelium dendriticum,NO.Y11236.1）、 東 方 岐 腔 吸 蟲 （Dicrocoelium orientalis，NO.EF547131.1）、 窄 體 吸 蟲（Lyperosomum collurionis，NO.AY222143.1）、雙腔吸蟲（Paraconcinnum leirsi，NO.JN831598.1）以及大片吸蟲（Fasciola gigantica，NO.AJ004804.1）18S RNA基因為參照序列進行序列比對及進化分析。結果表明，石河子分離蟲株與胰闊盤吸蟲聚為一支，親緣關系最近，與腔闊盤吸蟲的親緣關系次之。

3 討 論

寄生性吸蟲對全球人類以及動物的健康具有不可忽視的危害性，調查數據顯示，全球有超過4 000萬人感染食源性吸蟲病，同時有超過10%的人群存在感染的風險。大多數吸蟲病都流行于中低收入國家和地區[8]，其中闊盤屬吸蟲主要寄生于反芻動物的胰腺和膽管，該寄生蟲病廣泛流行于全球多個國家。盡管闊盤屬吸蟲病對人類和動物健康造成威脅，但該病仍然是被低估/忽視的吸蟲病之一。檢索CNKI數據庫顯示，胰闊盤吸蟲病在我國大多數地區均有發生，寄生宿主涉及牛、綿羊、山羊、以及野生的山麂等，同時有兩例胰闊盤吸蟲感染人的研究報道[4-5]，說明該病在我國普遍存在，且已有感染人的報道，應給予足夠重視。

本研究采用常規形態學鑒定和分子生物學方法對石河子地區綿羊胰闊盤吸蟲的感染情況進行了調查研究。試驗結果表明，在檢測的47只綿羊中，有6只綿羊存在胰闊盤吸蟲感染，感染率為12.77%。同時我們的前期研究還發現，除胰闊盤吸蟲外，在被檢的47只綿羊中，還存在其它5種吸蟲的感染，分別是寄生于肝臟的肝片吸蟲、矛形雙腔吸蟲、中華雙腔吸蟲、東方雙腔吸蟲以及寄生在小腸的斯氏吸蟲等，總的吸蟲感染率為100%[9]。究其原因，筆者認為有以下兩方面因素：一是此次調查的綿羊群所處的環境能夠滿足吸蟲整個生活史所需條件。本次調查的羊群屬于天然放牧飼養模式，該牧區水草豐茂，且吸蟲的中間宿主蝸牛、陸地螺、螞蟻等隨處可見，這為吸蟲生長發育提供了有利環境條件；二是目前大多數地區依然以阿維菌素為主要驅蟲藥物進行春秋兩季常規驅蟲，該藥物對體表寄生蟲以及胃腸道線蟲有較好的驅除作用，但對吸蟲幾乎無效。因此建議在牧區選用阿維菌素類藥物常規驅蟲的同時，還應考慮選用丙硫咪唑、三氯苯咪唑或吡喹酮等藥物加強對吸蟲病的防治。