綿羊鮮精低溫保存及應用技術研究

肖廣慶，劉新偉，李恒帥，侯玉武（河南省洛陽市畜牧良種繁育推廣中心，河南 洛陽 471013）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗器材

相差顯微鏡（OLYMPUS,日本），密度儀（IMV，法國），水浴鍋，數控冰箱，泡沫盒，度計,假陰道，保定架，輸精槍。

1.1.2 鮮精及實驗動物來源

供精羊為洛陽市畜牧良種繁育推廣中心羊場的4頭杜泊羊，4頭澳洲白和3頭純種薩?？搜蚍N公羊。實驗羊來自新安縣三森牧業有限公司湖羊。

1.1.3 鮮精低溫保存稀釋液配方：

短期保存液(3 d，以下稱 D液)：Tris 3.18 g，果糖0.68 g，葡萄糖0.38 g，檸檬酸1.88 g。加蒸餾水100 mL，加卵黃20 mL。用前還要在已配好的稀釋液里每毫升加青霉素和連霉素各1000國際單位。

長期保存液（13 d，以下稱C液）：D液每100 mL加入防腐劑 （食品添加劑）0.05 g，VE 5 mg，EDTA 0.1 g。

1.2 實驗分組及方法

1.2.1 實驗一：綿羊精液短期（3 d）保存活力衰減實驗

實驗目的：通過該實驗了解鮮精稀釋后存放溫度對活力的影響，找出最佳存放及運輸保存方式。實驗方法：羊采精后馬上用D稀釋液稀釋，然后分別放在室溫（常溫空調（15℃～25℃）、冰箱冷藏（0℃～4℃），泡沫盒放冰袋（0℃～8℃））保存，觀察活力情況。為減少原精活力差別，采用同只羊精液稀釋后三等分標注A/B/C分別存放。

1.2.2 實驗二：不同品種綿羊精液相同保存狀態活力衰減實驗

實驗目的：通過該實驗了解羊鮮精用相同稀釋液稀釋后在相同保存狀態下，不同品種間鮮精保存活力影響差異。實驗方法：不同品種羊精液用同種稀釋液稀釋，放置冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，觀察活力情況。

1.2.3 實驗三：長期保存稀釋液稀釋存放時間實驗

實驗目的：觀察長效稀釋液在低溫存放狀態下最長保存時間及品種間差異性。實驗方法：不同品種綿羊精液用C稀釋液稀釋后放置在冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，觀察活力衰減及品種間差異。

1.2.4 實驗四：綿羊鮮精低溫保存不同存放時間受胎率實驗。

實驗目的：鮮精低溫保存目的在于其配種后的受精能力是否受影響，通過該實驗了解羊鮮精低溫保存時間對受胎率的影響，從而為實際生產提供依據。實驗方法：在新安縣三森牧業有限公司羊場挑選90日齡母羊，經同期發情處理，用低溫存放1 d、2 d、3 d的鮮精輸精，采用常規陰道（子宮頸口）輸精方式，40 d后B超檢查受胎情況。

1.2.5 保存狀態及精液檢測

冰箱存放：鮮精稀釋后，把盛有精液的集精杯放入試管架浸泡水中再放入冰箱（達到緩慢降溫），冰箱溫度用溫度計校準后使用。冰袋泡沫盒保存：用壁厚2～3 cm泡沫盒，體積適中，冰袋與精液透氣隔開，密封保存。室溫保存：用泡沫盒密封保存。空調溫度設置25℃。所有保存方式用溫度計測試溫度并記錄?；盍τ^察：用相差顯微鏡，在400倍顯微鏡下評定鮮精活力，顯微鏡載物臺的溫度應保持在38℃～40℃，共選取3個以上視野評估。每4 h觀察一次。密度：取原精10 μL，用0.9%生理鹽水稀釋400倍，放入密度儀中直接讀取。稀釋倍數：均按1：3倍稀釋。

2 結果與分析

2.1 實驗一

綿羊精液短期（3 d）保存活力衰減實驗。2018年3月16日選取洛陽市畜牧良種繁育推廣中心種羊場杜泊羊DB16102采精，連續兩次采精，射精量2.4 mL，等分3份，每份0.8 mL，原精活力91.56%±0.23%，密度36.23±0.5億，用D稀釋液1：3倍稀釋后保存如表1。

表1 不同狀態鮮精保存活力情況表

結論：同一只羊，相同稀釋液及稀釋比例，在冰箱或冰袋存放狀態下活力差異不顯著。3 d活力衰減分別為3.5%、4.4%，經10次重復試驗，活力衰減在5%以內，冰箱或冰袋存放差異不顯著（P＞0.05）。常溫存放（最好2 h之內用完，適合現配現用），最長8 h，最短6 h，與原精活力有關，原精活力好存放時間長，原精活力差存放時間短。

2.2 實驗二

不同品種綿羊精液相同保存狀態活力衰減實驗。2018年3月22日，挑選洛陽市畜牧良種繁育推廣中心種羊場杜粕羊、澳洲白、薩福特原精活力較好（80%）以上的，用D稀釋液1：3倍稀釋后分品種混合,放冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，見表 2。

表2 不同品種綿羊冰箱冷藏保存3 d活力實驗

結論：品種間相同稀釋液冰箱冷藏存放，3 d活力衰減分別是4.2%、3.6%、3.6%，品種間活力衰減差異不顯著(P＞0.05），均在 5%以內。

2.3 實驗三

長期保存稀釋液稀釋存放時間實驗。2018年8月22日，把同品種羊精液（80%）以上活力用C稀釋液1：3倍稀釋后混合，冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，結果見表3。

表3 不同品種綿羊鮮精冷藏狀態下存放時間實驗

結論：在冷藏條件下，長效稀釋液最長可保存13 d（活力達到0.35以上），第14 d快速衰竭至0。在當今物流條件下，由于公羊站3 d之內供精可輻射國內任何以地區，所以，長效保存僅限于理論研究?？蔀槠h地區如西藏、新疆等地提供理論支持。

2.4 實驗四

綿羊鮮精低溫保存不同存放時間受胎率實驗。2018年8月在新安縣三森牧業有限公司選擇舍飼湖羊待配母羊90只,中等膘情，30只一圈分別為A、B、C三圈。分別用1 d、2 d、3 d存放鮮精配種。

把A、B、C三圈羊分別于 2018年8月 15、16、17日上午放置進口海綿栓，第13 d（27日/28日/29日）上午撤栓打針，每只注射300單位孕馬血清，第15 d（29/30/31日）上午輸精。第14 d（8月28日）上午采精，用D稀釋液1：3稀釋后放冰箱冷藏保存。輸精量每只母羊輸鮮0.2 mL一次，2次輸精。90頭份共需鮮精36 mL（30頭份12 mL一試管A/B/C分開保存）。輸精時取出鮮精33℃水浴存放。具體情況見表4。

表4 綿羊鮮精保存時間長短受胎率實驗

由表2可見，精液低溫保存活力衰減較低，但受胎率差異顯著(P＜0.05）。鮮精冷藏24 h受胎率＞鮮精冷藏48 h＞鮮精冷藏72 h。其中鮮精冷藏1 d與第2 d受胎率減少6.7%，存在顯著差異（P＜0.05）；第1 d與第3 d受胎率減少16.7%，存在極顯著差異（P＜0.01）。說明精液低溫保存時間對受胎率有一定的影響，盡量縮短保存時間。用低溫保存后的鮮精做人工輸精，雖然返情率較高,但排除人工授精和同期發情不利因素，總體看效果還是令人滿意的。

3 討 論

近年來我國養羊業發展迅速，規模養殖蓬勃發展，但羊人工授精技術相對滯后。尤其是在我國綿羊凍精生產與應用技術還不十分成熟的情況下,廣泛推廣羊鮮精低溫保存技術，為羊人工授精技術推廣、種公羊站建設推廣提供技術支撐，從而提高優秀種公羊利用效率，降低種羊場飼養種公羊費用，提高良種覆蓋率及改良效果。

羊人工授精受胎率受精液活力、人工授精技術、羊發情鑒定技術、羊同期發情技術、飼養管理技術等影響，需要逐步進行規范研究，制定相關技術規范，才能實現穩定提高的目的。