骨髓間充質干細胞通過激活Wnt通路防治阿爾茨海默病

陳鵬 姚宏波

(齊齊哈爾醫學院 1口腔醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2基礎醫學院組胚教研室)

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性發展的中樞神經系統退行性疾病。臨床表現為記憶能力的失活、失用，執行功能障礙，認知能力下降，同時多出現精神行為的異常，對中老年人身心健康產生嚴重危害。近年來，應用干細胞治療AD逐漸被認可，其中骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一種專能干細胞，來源于骨髓，具有自我更新和多向分化的能力，可以在特定的條件下轉變成構成人體某種組織的細胞，BMSCs來源廣泛，能為AD的治療提供豐富資源，也為臨床的自體細胞移植奠定了實驗基礎〔1〕。Wnt信號通路在神經系統的發生、發育及神經系統疾病的發生、發展等方面發揮重要作用，如軸突導向、突觸形成、成年神經再生和神經細胞的保護和遷移等〔2〕。有研究顯示，Wnt/β-catenin 信號的激活可以促進成體動物神經干細胞的增殖及向神經元分化〔3〕。本研究通過在AD大鼠海馬區移植BMSCs，探討在治療AD的過程中是否存在Wnt通路的激活及對Wnt通路相關蛋白β-catenin及細胞周期蛋白(Cyclin)D1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 6～8月齡清潔級雄性Wistar大鼠，體重(200 ± 20)g，來自哈爾濱醫科大學實驗動物中心。兔抗β-catenin，Cyclin D1抗體一抗；羊抗兔 IgG；二氨基聯苯胺(DAB)顯色法檢測試劑盒；β-淀粉樣蛋白(Aβ)23～35；氫溴酸加蘭他敏。

1.2 動物分組及處理 將40只大鼠隨機分為5組，每組8只，正常組：常規鼠糧飼養，飲用水；模型組：稱重后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀，切開皮膚暴露頂骨，按照大鼠腦立體定位儀圖譜在雙側海馬區注射10 μl Aβ23～35，緩慢注射5 min注完，注射結束需繼續留針5 min，將骨孔用牙托粉封固，皮膚縫合，前3 d，每日肌注10萬U青霉素。常規飼養7 d后，用Moriss水迷宮檢測造模是否成功，成功后不進行任何治療；模型對照組：注射生理鹽水代替Aβ23～35，方法同模型組；移植組：建立AD大鼠模型2 w后，對AD模型大鼠進行BMSCs移植，注射部位為原Aβ23～35的注射部位，術后處理同模型組；西藥組：建立AD大鼠模型后，氫溴酸加蘭他敏灌胃治療，每日每千克體重0.6 mg，治療30 d〔4〕。

1.3 BMSCs的培養、鑒定及移植 原代培養，將大鼠麻醉后在無菌條件下取雙側股骨，將兩側干骺端剪斷，注射器將骨髓沖出，淋巴細胞分離離心，去上清，取云霧狀細胞，接種于75 cm2培養瓶中，密度5×105/cm2，培養體系為DMEM培養基、10%胎牛血清、青/鏈雙抗，隔日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。當細胞約80%匯合時，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)進行消化，然后終止消化用含胎牛血清的培養液，制成單細胞懸液后進行傳代，細胞擴增好后對其進行CD44免疫組化染色鑒定。檢測造模成功后，行BMSCs移植，注射部位為原Aβ23～35的注射部位，將BMSCs懸液注入AD模型大鼠雙側海馬區，每側10 μl緩慢注射，1 μl/min，留針約5 min。染色后BMSCs陽性為胞核藍色，胞質褐色。

1.4 行為學實驗 Morris水迷宮的組成：一個不銹鋼圓形水池和一個可以移動的平臺。水池上方有攝像機和監視器與計算機相連，跟蹤記錄大鼠游泳軌跡和游泳時間。水池被等分為平臺象限、對側象限、右側象限和左側象限4個象限，并用不同形狀進行標記。在平臺象限正中放置平臺，將大鼠頭部染成黑色，將大鼠面向池壁，在其他3個象限中任一點放入水中。記錄大鼠逃避潛伏期，即每次自入水至爬上平臺的時間。方法如下：將大鼠編號，第1天讓大鼠適應環境，自由游泳2次，每次120 s；第2天起，每天上、下午各進行水迷宮訓練1次，連續3 d，共計6次，訓練時間同上，120 s未找到平臺則以120 s計算，為了加強記憶，每次訓練后，將大鼠引導至平臺上15 s。記錄大鼠平均逃避潛伏期。

1.5 形態學實驗 取腦組織海馬進行石蠟切片制作并采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察海馬神經元的形態及超微結構的改變。HE染色步驟：①石蠟切片二甲苯脫蠟；②梯度乙醇脫水至蒸餾水水洗；③蘇木精染色；④自來水稍沖洗；⑤1%鹽酸乙醇分化、水洗；⑥伊紅復染；⑦酒精脫水；⑧二甲苯透明、自然干燥；⑨封片。光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 免疫組化染色 采用PV二步法進行免疫組化檢測各組AD大鼠海馬Wnt信號通路β-catenin及Cyclin D1蛋白的表達，對照組一抗用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，光學顯微鏡下觀察。

1.7 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行方差分析；圖像處理應用ImageJ。

2 結 果

2.1 BMSCs的培養、鑒定及移植 BMSCs呈細長纖維狀，貼壁生長后變成長梭形，分布呈漩渦樣，折光性好，形態飽滿。染色后可見BMSCs表達陽性，陽性細胞比例在99%以上。

2.2 行為學檢測 模型組與正常組、模型對照組比較，逃避潛伏期及游泳路程明顯增長(P<0.01)；移植組和西藥組明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3 形態學變化 正常組和模型對照組海馬區錐體細胞和顆粒細胞胞質豐富，排列規則且整齊緊密，層數較多。模型組錐體細胞和顆粒細胞可見被破壞現象，胞質濃縮染色較深，核固縮，細胞排列稀疏且紊亂，細胞體積縮小，間隙擴大。移植組和西藥組顆粒細胞核圓，但細胞數量較正常組減少，細胞排列較規整，界限較清晰。見圖1。

表1 各組平均逃避潛伏期及游泳路程比較

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；下表同

圖1 各組海馬HE染色(×400)

2.4 免疫組化檢測結果 正常組和模型對照組β-catenin蛋白在大鼠海馬神經元的胞質內陽性表達；模型組陽性表達細胞數明顯減少(P<0.01)；移植組和西藥組明顯多于模型組(P<0.05)。正常組、模型對照組Cyclin D1蛋白在細胞核內表達；模型組陽性表達明顯降低(P<0.01)；移植組和西藥組明顯多于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 各組海馬蛋白β-catenin 及Cyclin D1表達陽性細胞數個/mm2,n=8)

3 討 論

AD病因目前尚不明確。根據2010年失智癥報告顯示，全球AD患者約有3 560萬例，且增長速度約每20年翻1倍，估計到2030年AD患者將達約6 500萬例，且發展中國家居多〔5〕。AD主要有三大病理改變：Aβ形成、tau蛋白的過度磷酸化及神經炎癥，其產生的神經毒性最終導致大量海馬神經元凋亡。

BMSCs具有多向分化的潛能，應用不同的誘導劑可分化為多種細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞及神經元等〔6〕，故近些年BMSCs被作為移植治療多種疾病的種子細胞〔7〕。在體內外實驗中，BMSCs在適當的條件下可誘導分化為神經元，但調控機制目前尚不清楚。據報道，BMSCs在定向分化過程中，Wnt信號通路具有一定的調控作用〔8〕。Wnt/β-catenin信號通路是最經典的Wnt通路，Wnt 3a蛋白與細胞膜上的相應受體結合，Wnt信號通路被激活，使未被磷酸化的β-catenin從細胞質進入細胞核，并啟動相應靶基因的轉錄，從而產生多種細胞效應〔9〕。其中激活Wnt 信號通路后，可啟動靶基因Cyclin D1 的轉錄〔10〕。Beaulieu等〔11〕發現，在Wnt /β-catenin 通路激活劑或Wnt 配體作用下，可增強 β-catenin蛋白的表達及該通路下游靶基因中存活基因如 Cyclin D1的表達，減弱 Aβ 的神經毒性，對神經元起保護作用。有研究還發現Cyclin D1的調控機制有利于Cyclin D1在 AD 病理發展中作用的研究〔12〕。

目前有報道證實，通過Wnt信號通路的激活可使AD大鼠腦組織內的炎癥得到改善〔13〕。BMSCs在向神經元分化時，胞質內游離β-catenin蛋白的表達明顯增加；而Wnt信號通路受到抑制時，BMSCs的分化明顯減少〔14〕。所以推斷Wnt 信號通路對AD的發生有嚴重影響，但目前許多機制仍不明確，還有待繼續研究〔15〕。本研究顯示，BMSCs移植可以縮短AD模型大鼠的逃避潛伏期和游泳路程，對學習記憶能力起到改善作用；模型組胞質內游離的 β-catenin 減少，抑制了Wnt信號通路的轉導，從而使靶基因 Cyclin D1 的表達有所下調。經過BMSCs移植后，胞質內游離β-catenin表達增多，激活了Wnt信號通路，使Cyclin D1 的表達增強，并且能夠促進神經元之間突觸的發生。因此，BMSCs移植治療AD的機制可能是通過激活Wnt/β-catenin通路，調控細胞周期，從而起到保護神經元的作用。

BMSCs具有高分化潛能，可以實現自體移植，具有低免疫原性，避免了移植后的排斥反應。同時，BMSCs易于獲取，故不涉及醫學倫理問題，作為組織工程的種子細胞，具有十分廣闊的應用前景〔16〕。