血管內皮生長因子通過PI3K-Akt和MAPK-ERK通路促進腦梗死大鼠血管新生機制

周經霞 陳琳 陳擘璨 邢槐杰 閆麗敏 曾超勝 吳海榮 黃裕盛 陳接桂

(海南醫學院第二附屬醫院神經內科，海南 海口 570031)

腦梗死是由于生活方式、飲食習慣等多方面因素造成的一種腦血流異常疾病，如腦部血流的減少或中斷，進而促使腦組織發生缺氧、缺血甚至導致腦壞死等〔1,2〕。在腦梗死的病變過程中，腦缺血灶附近的缺血半暗帶部位損傷是可逆的〔3〕，因此在缺血早期給予改善或進行及時的血液供應可逐步改善恢復到正常的組織水平。血管新生是目前改善血供的一種有效方法，同時是缺血性疾病恢復和損傷修復的關鍵步驟〔4〕。血管新生對腦梗死后的作用過程短暫，但由于血管新生對神經細胞具有較強的可塑性作用，可為其帶來持久性的恢復〔5〕，因此可通過人為誘導血管新生進而促進缺血區域新血管的形成成為腦梗死治療的重要方法。血管內皮生長因子(VEGF)是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子〔6～8〕。研究發現VEGF具有高效的誘導機體內皮細胞增殖，促進機體血管的生成，可用于調節機體微血管的通透性等有益功能〔9〕。近年來，VEGF被用來治療常規方法難以解決的由血循環異常導致的各種疾病〔10〕。盡管目前醫學上對于VEGF治療腦梗死等缺血性疾病已經有所了解，但其作用機制尚不明確。本研究擬探討VEGF通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)-胞外信號調節激酶(ERK)通路促進腦梗死大鼠血管新生的機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選取120只SPF級的SD大鼠(購自北京醫科大學動物實驗中心)，體重200～310 g，每天7∶00～19∶00進行光照，室內溫度為22～28℃，相對濕度為60%。所有實驗大鼠每天自由活動，并給予充足的飲水及食物。

1.2 實驗動物分組 120只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、VEGF 1組、VEGF 2組各30只。1 w正常飼喂后進行不同的飼養方法，正常組每天注射生理鹽水，模型組經頸外動脈進線制造右側大腦中動脈阻斷(MCAO)模型，VEGF 1、2組實施MCAO處理的同時于前囟偏右5 mm、向后3 mm處顱骨鉆孔，用50 μl注射器進入約3.5 mm后給予80 ng/只(VEGF 1組)和120 ng/只(VEGF組2)的VEGF干預。

1.3 神經功能評價 大鼠MCAO后，于12 d采用Zea-Longa 5分法〔11〕進行神經功能評分，0分為無功能損失狀況；1分為大鼠在被提起尾巴倒懸時，右前肢不能正常伸直；2分為行走時向左轉圈；3分為向左側傾倒；4分為不能行走或無意識。根據神經功能評分結果，對0～4分、生命體征不平衡、呼吸困難、死亡及處死后顱內出血的大鼠均棄之不用。于實驗過程中造模失敗的大鼠在后續實驗中給予補充。

1.4 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法評價大鼠腦梗死體積 在建模后第12天，取5只大鼠，采用11%的水合氯醛腹腔注射，斷頭取腦，切成2 mm厚的腦片，浸泡于3%TTC溶液中，避光條件下，37℃染色30 min，而后在4℃條件下置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h。正常組織為紅色，腦梗死灶為蒼白色。采用計算機圖像處理軟件進行處理分析，測量梗死面積〔12〕。

1.5 Neuron染色方法 取2 mm厚的冰凍腦片，于室溫復溫，丙酮固定，于37℃用牛血清白蛋白孵育30 min，后滴加一抗于4℃孵育過夜，復溫后滴加二抗孵育1 h，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚后避光封片，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.6 免疫組化法檢測腦梗死大鼠腦組織PI3K-Akt和MAPK-ERK表達 每組取5只大鼠，11%的水合氯醛麻醉后置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，迅速斷頭取出腦組織。一抗采用小鼠抗大鼠PI3K-Akt單克隆抗體(1∶1 000)和小鼠抗大鼠MAPK-ERK單克隆抗體(1∶1 000)，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液，4℃孵育過夜，二抗按說明書孵育30 min，使用二氨基聯苯胺顯色。每個標本高倍鏡下采集圖片，最后用Image pro-plus成像系統分析照片。并進行微血管計數(MVD)，計數方法以內皮細胞簇為單位標準，管腔內直徑大于8個血管內紅細胞或肌層較厚的予以排除，取平均值〔13〕。

1.7 實時熒光-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA轉錄水平 11%的水合氯醛麻醉，迅速斷頭取腦，取切割好的大鼠腦組織少量，采用液氮凍干研磨成粉狀，用RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(普利萊)進行大鼠腦組織RNA提取和反轉錄，反轉錄后cDNA產物采用RT-PCR法檢測PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 各引物設計結果

1.8 Western印跡法檢測PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達水平 待實驗結束時，每組取4只大鼠，11%的水合氯醛麻醉，迅速斷頭取腦，取150 mg腦組織，提取蛋白，采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行蛋白分離，而后進行半干轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，并用PI3K-Akt和MAPK-ERK抗體孵育過夜，TBST清洗后，用辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育，暗室曝光，用凝膠成像系統(美國UVP公司)采集圖片，用LABWORK軟件分析灰度值，以β-actin為內參，計算其比值。

1.9 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 Zea-Longa 5評價結果 給藥前各組Zea-Longa 5評分不存在顯著性差異(P>0.05)；但給藥后第12天正常組和VEGF 1、2組的Zea-Longa 5評分均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.2 TTC染色結果 由圖1可知，MCAO處理后大鼠腦組織出現白色區域即壞死的腦組織，當用VEGF處理后，白色區域縮小，且VEFG濃度越高，其腦梗死的體積越小， VEGF對腦梗死大鼠具有一定的保護作用。

表2 各組不同時間Zea-Longa 5評分結果分)

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

圖1 各組腦梗死灶TCC染色結果

為了更清楚地觀察，在建模后第12天，采用Neuron染色法對神經元缺失程度進行熒光染色后評價。由圖2可知VEGF 1、2組Neuron染色出現的陽性區域大于模型組和正常組，表現為VEGF對腦梗死組織起到一定的保護作用。

2.3 免疫組化法檢測腦梗死大鼠腦組織PI3K-Akt和MAPK-ERK表達及MVD 造模后第12天，與模型組相比，正常組和VEGF 1、2組PI3K-Akt、MAPK-ERK表達及MVD均顯著增高(P<0.05)，且MAPK-ERK表達與VEGF濃度之間存在一定的依賴性。見表3。

圖2 各組Neuron染色結果

表3 造模后第12天各組腦梗死組織PI3K-Akt、MAPK-ERK表達及

2.4 RT-PCR法檢測PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA轉錄水平 造模后第12天后，模型組PI3K-Akt、MAPK-ERK表達水平顯著低于正常組和VEGF 1、2組(P<0.05)，且PI3K-Akt表達與VEGF濃度之間存在一定的劑量依賴性，見圖3、表4。

圖3 各組PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA表達

2.5 Western印跡法檢測PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達 造模后第12天，正常組和VEGF 1、2組PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.05)，見圖4、表5。

表4 造模后第12天各組PI3K-Akt和MAPK-ERKmRNA表達

圖4 各組PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達

組別PI3K-Akt/β-actinMAPK-ERK/β-actin正常組0.72±0.121)0.76±0.031)模型組0.27±0.010.24±0.04VEGF 1組0.89±0.051)0.91±0.031)VEGF 2組0.96±0.031)1.01±0.041)F/P值12.651/0.00119.228/0.001

3 討 論

近年來，腦梗死在老年人群中屬于常見的一種多發病，腦梗死及其并發癥也成為臨床研究的重點〔14〕。“神經血管單元”概念特別強調了神經修復、血管新生為切入點，通過外界干預來促進腦缺血半暗區部位的血管形成，進而有助于機體的神經功能恢復。研究發現，血管新生是指由血管內皮干細胞產生的血管內皮細胞〔15〕。而VEGF對血管內皮細胞具有較強的特異性親和作用，因此可在機體血管形成的環節中起著不可替代的作用。

PI3K-Akt是機體細胞正常生理活動的關鍵分子，可用于調節細胞增殖和生長〔16〕。研究發現，PI3K-Akt和MAPK-ERK通路處于活躍狀態時，能夠有效促進機體腫瘤細胞的轉移和侵襲能力，而這個過程與VEGF關系密切〔17〕。PI3K-Akt信號通路在腦組織中廣泛存在，其中Akt作為PI3K的下游信號因子，控制著機體蛋白質合成、細胞周期及血管新生的進展〔18〕。研究發現PI3K-Akt能夠在基因水平上促進與VEGF的合成，VEGF序列的啟動子近端含有豐富的GC區域，這個區域內具有多種轉錄因子，而PI3K在受到外界信號的刺激時，可通過調節亞基磷酸化，同時Akt基因的Ser473也被磷酸化，從而促進PI3K-Akt激活，且刺激蛋白(SPI)上的Thr453和Thr739同時被磷酸化，最終啟動VEGF基因轉錄〔19〕。本研究通過外界補充VEGF促進機體PI3K-Akt表達，從而刺激機體內部產生VEGF，達到促進血管新生的目的。

MAPK-ERK級聯通路是目前研究血管內皮細胞的信號傳導過程的主要途徑。MAPK-ERK信號通路屬于高度保守的三級激酶級聯的傳遞信號，即Raf-MEK-ERK，這條通路是經典的調節機體細胞生命活動及其他多種病理機制的研究重點〔20〕。VEGF能打通此通路，且隨著VEGF濃度的增加此過程的蛋白激酶活性越強。

綜上，VEGF可通過刺激PI3K-Akt和MAPK-ERK通路活化，促進大鼠腦梗死組織血管內皮細胞的產生，達到抑制腦梗死病變體積增大的目的，為腦梗死的治療提供了理論基礎。