糖尿病腎病患者血清miR-21、CysC與氧化應激指標的關系及其診斷價值

宋娜 蘇東峰 高宇 劉曉燕 韓桂艷 李麗慧 劉暢

(承德醫學院附屬醫院內分泌科，河北 承德 067000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴重的并發癥，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因〔1，2〕，在終末期腎病患者死亡原因中占第二位。血清胱抑素(Cys)C是評價腎功早期損傷的敏感指標，與血肌酐、尿素氮等指標比較更加穩定，不受炎癥、肌肉含量等的影響，是反映糖尿病患者腎功能損傷的理想指標〔3〕。微小RNA(miR)是一類非編碼小分子單鏈RNA，通過調控靶基因表達水平而廣泛參與生物體內各種生理和病理過程，隨著對miR研究的深入，有證據表明miR參與了糖尿病及其并發癥的發生發展過程〔4〕，因而可將其作為糖尿病及其并發癥診斷與治療的靶點。本研究擬分析糖尿病患者miR-21與CysC和氧化應激指標間的關系及其診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月至2017年1月在承德醫學院附屬院診斷為2型糖尿病并接受住院治療的患者105例，男61例，女44例，年齡50～77〔平均(54.3±10.7)〕歲。納入標準：①DN診斷符合世界衛生組織(WHO)糖尿病專家委員會推薦的糖尿病診斷標準〔5〕；②DN診斷依據Mogenson分期標準〔6〕；③本人或其家屬自愿參加本研究，接受研究中使用的檢驗方法。排除標準：①已經確診的1型糖尿病或其他類型糖尿病；②腎臟實變，其他原因導致的腎臟疾病，進行血液透析治療的患者；③甲狀腺功能異常、酮癥酸中毒患者；④近期服用免疫抑制劑、腎臟毒性藥物等影響腎臟功能的藥物。

依據尿蛋白排泄率(UAER)將患者分為：A組：單純糖尿病組，37例；B組：早期DN組，40例；C組：臨床DN組，28例。另選30例在體檢中心檢查身體的健康者作為對照組，男女各半，平均年齡(52.9±11.5)歲，排除糖尿病、腎炎、代謝性疾病等。本研究經過醫院倫理委員會審核通過，所有研究對象自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 診斷標準 糖尿病診斷標準：具有多飲、多尿、不明原因體重下降等典型糖尿病癥狀，隨機血糖≥11.1 mmol/L，或者空腹血糖≥7.0 mmol/L，或者口服75 g葡萄糖后2 h血糖≥11.1 mmol/L。DN Mogenson分期：排除引起尿蛋白的其他原因(如腎炎、發熱、泌尿系統感染)后，20 μg/min200 μg/min為臨床DN。

1.3 檢驗方法 所有研究對象禁食8 h以上，并于入組后次日清晨采集空腹靜脈血10 ml，分兩管采集，一管在室溫靜置20 min后3 000 r/min離心15 min，分離得到血清分裝至EP管中，保存于-80℃冰箱備用，帶所有標本采集齊全后，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NOX4、CysC的濃度，試劑盒購自美國R&D公司，操作嚴格按照說明書進行。另一管采用Trizol法提取血漿總RNA，采用美國Bio-Rad公司的RT-PCR試劑盒逆轉錄合成cDNA，采用Bio-Rad公司的SYBR定量PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測miR-21的表達，表達水平采用2-ΔΔCt法進行計算，引物和內參基因均通過GenBank檢索得到，由Takara公司合成，mimics(內參)正義鏈：5′-GACTTCATCACCGGGTGTAAATC-3′，反義鏈：5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3′；miR-21正義鏈：5′-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3′，反義鏈：5′-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3′。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析和多重比較HSD-q檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析，診斷價值分析采用受試者工作特征(ROC)分析。

2 結 果

2.1 氧化應激指標、CysC和miR-21比較 C組miR-21表達水平最低。C組SOD濃度和miR-21表達水平顯著低于對照組和A、B組(均P<0.05)，C組MDA、NOX4、CysC濃度顯著高于對照組和A、B組(均P<0.05)，其余組間比較結果見表1。

表1 不同組間氧化應激指標、CysC和miR-21比較

與對照組比較:1)P<0.05；與A組比較:2)P<0.05；與B組比較:3)P<0.05

2.2 相關性分析 以DN患者(B、C兩組)資料為樣本(n=68)，將其miR-21與CysC、氧化應激指標作相關性分析。結果DN患者miR-21與SOD呈正比(r=0.537)，與MDA、NOX4呈反比(r=-0.452，-0.518)，與CysC呈反比(r=-0.630)，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

2.3 ROC分析 將A、B、C 3組miR-21資料(共105例樣本)建立ROC曲線分析模型，ROC曲線下面積(AUC)為0.802(0.95%CI=0.680～0.922)，理論閾值點C處miR-21水平為0.56(取整后)，對應的敏感度Se為0.765，特異度為0.760，均在0.76以上，提示miR-21確實有較好的早期DN的診斷價值，見圖1。

圖1 miR-21診斷DN的ROC曲線

3 討 論

DN發病隱匿，早期DN沒有明顯癥狀，而此期腎損傷可以逆轉，一旦發展為DN則不可逆轉，因此早期及時診斷對于治療和預后具有重要意義〔7，8〕。腎小球濾過率是評價腎功能的指標，臨床上采用的金標準是99mTc-DTPA血漿清除率雙血漿法，但檢測方法復雜，應用不是很理想〔9〕。目前臨床上常用UAER進行診斷，但易受尿量、酮癥、尿路感染等因素影響，并且UAER出現異常時，患者已經發展到Ⅲ期，不夠靈敏。血清CysC是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，所有有核細胞都能分泌，不受性別、年齡等因素影響〔10〕，并且腎臟是其唯一清除器官，因此其清除率主要由腎小球濾過率決定，能夠靈敏反映腎臟損傷程度〔11〕。本研究也證實早期DN患者血清CysC濃度即顯著升高，發展至DN時進一步升高。

在DN的發展過程中，血清CysC水平升高能夠影響細胞的吞噬和趨化功能，激活氧化應激反應。氧化應激反應是DN發生的重要病理過程，血糖控制不良，糖基化終末產物增加促進氧自由基生成，引起腎小球內皮細胞、基底膜細胞等發生氧化損傷〔12〕。本研究對DN患者氧化應激指標檢測發現，DN患者SOD水平降低，MDA和NOX4水平顯著增加。生理狀態下體內也會產生少量活性氧簇，但是很快會被體內的SOD、過氧化氫酶等清除，過量的活性氧會消耗SOD，氧化不飽和脂肪酸產生MDA。NOX4是NADPH氧化酶的一個主要催化亞基，具有催化活性氧生成的作用〔13〕，而NOX4的表達受到miRNAs調控，Fu等〔14〕首次發現miR-25通過調控NOX4的表達影響DN的發生過程，他們在體外研究中通過轉染miR-25顯著抑制了NOX4的表達，進而抑制NADPH氧化酶的活性，降低幅度達到51%。

此外，Dey等〔15〕發現糖尿病鼠模型的腎皮質中miR-21表達水平顯著升高，進一步研究發現miR-21通過調控磷酸酶及張力蛋白同源基因PTEN的表達抑制其表達產物腫瘤抑制蛋白的表達，導致纖連蛋白表達增加，導致腎細胞肥大和纖連蛋白增加。本研究表明miR-21確實參與了DN的氧化應激過程，并且與體內氧化應激程度密切相關。而對miR-21與CysC的相關性分析顯示二者呈負相關，與Zhang等〔16〕在DN小鼠模型上觀察到的結果一致，提示miR-21高表達能夠減少蛋白質排泄率，是DN的保護因素。

本研究發現單純糖尿病患者血清miR-21較高，早期DN患者和DN患者血清miR-21水平顯著降低，表明miR-21可能與腎小球濾過率相關，Szeto等〔17〕對DN患者尿沉渣miR-21表達量的研究也證實高水平的miR-21與患者血液透析生存期長密切相關，提示miR-21對于診斷DN包括早期DN具有重要價值。此點亦經ROC曲線分析予以證實。提示miR-21表達量可能是較好地診斷早期DN的敏感指標，其與糖尿病患者腎功能損傷、氧化應激狀態具有密切關系，或可作為DN的潛在分子診斷指標。