基于線粒體ND6基因檢測犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的糞便PCR方法

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細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，Eg)的生活史較為復(fù)雜，要通過中間宿主—某些家畜(如牛、羊等食草動物)和終末宿主犬科動物來共同完成，其中細(xì)粒棘球絳蟲的中絳期幼蟲-細(xì)粒棘球蚴主要寄生在中間宿主的肝臟和肺臟內(nèi)，從而引起細(xì)粒棘球蚴病(囊型包蟲病)(Echinococcosis)[1-2]。該病為一種人獸共患寄生蟲病，呈世界性分布，其中我國屬高發(fā)地區(qū)之一，目前至少有368個流行縣[3]，主要流行于青海、新疆、西藏、四川西北部牧區(qū)以及寧夏。現(xiàn)該病已被列為我國《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃》(2012-2020)年優(yōu)先防治和重點防范的動物疫病[4]。

犬是細(xì)粒棘球絳蟲最重要的終末宿主和傳染源。犬吞食棘球蚴后，原頭蚴在其小腸內(nèi)經(jīng)40～50 d便可發(fā)育為成蟲，成蟲在犬體內(nèi)的壽命為5～6個月。成蟲孕節(jié)及蟲卵隨犬糞排出并污染食料、水源及環(huán)境，中間宿主經(jīng)口食入蟲卵而受到感染，從而引起囊型包蟲病[5]。如能及時準(zhǔn)確地掌握犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的情況，對人和動物包蟲病的防控均具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，線粒體DNA(mtDNA)基因已被廣泛應(yīng)用為生物分子診斷標(biāo)記及分子遺傳標(biāo)記[6-9]。線粒體ND6基因(ND6)全序列長度相對較短，結(jié)構(gòu)簡單無內(nèi)含子，進(jìn)化速率適中，序列變異豐富，突變率顯著高于核DNA，目前已被廣泛應(yīng)用于牦牛、魚類及昆蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)分析[10-13]。本研究選擇細(xì)粒棘球絳蟲的ND6基因作為分子標(biāo)記，進(jìn)行了犬糞中細(xì)粒棘球絳蟲DNA的分子檢測及基因分型研究。

1 材料與方法

1.1樣品收集 細(xì)粒棘球絳蟲(18日齡童蟲蟲體)、孟氏迭宮絳蟲(Spirometramansoni)、豆?fàn)顜Ы{蟲(Taeniapisiformis)、犬復(fù)孔絳蟲(Dipylidiumcaninum)、多頭帶絳蟲(Taeniamulticeps)、泡狀帶絳蟲(Taeniahydatigena)及犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)樣品DNA由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心提供；多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)樣品DNA由中國CDC上海寄生蟲病研究所黨志勝博士惠贈。

1.2糞樣收集 對2只家犬(1號犬 、2號犬)進(jìn)行藥物驅(qū)蟲后，每只飼喂約50 000條的原頭蚴。感染第3 d到18 d，每天分別收集2只犬的糞便；40份待檢臨床犬糞隨機(jī)采自四川省甘孜州包蟲病流行區(qū)，由甘孜州動物疫病預(yù)防控制中心采集并提供；豆?fàn)顜Ы{蟲(5份)、多頭帶絳蟲(5份)及泡狀帶絳蟲(2份)的犬糞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心提供。將以上所有糞樣均置于-80 ℃ 2周以上進(jìn)行無害化處理。

1.3 方 法

1.3.1提取糞便DNA 按照Qiagen DNeasy Powersoil試劑盒(Qiagen, Carlsbad, CA)說明書提取犬糞便DNA。

1)將60 μL Solution C1加入到PowerBead Tubes中混勻；2)再次加入約0.25 mg的犬糞樣品到PowerBead Tubes后輕輕渦旋混勻；3)把PowerBead Tubes固定在渦旋儀適配器上，3 200 r/min渦旋連續(xù)振蕩10～20 min；4)室溫下10 000 g離心PowerBead Tubes 30 s，轉(zhuǎn)移上清至一個干凈的2 mL Collection Tube中；5)加入250 μL Solution C2到上清中，渦旋混勻5 s，4 ℃孵育5 min；6)室溫10 000 g離心Collection Tube1min，轉(zhuǎn)移上清≤600 μL到一個新的收集管中；7)加入200 μL Solution C3到上清中，渦旋混勻，4 ℃孵育5 min；8)室溫10 000 g離心Collection Tube 1min，轉(zhuǎn)移上清≤750 μL到一個新的收集管中；9)加入1 200 mL搖勻的Solution C4到上清中，渦旋混勻5 s；10)加載約675 μL上清到 Spin Filter中，室溫10 000 g離心1 min，棄去濾液；11)重復(fù)9)直至過濾完所有上清；12)加入500 μL Solution C5到MB Spin Filter中，室溫10 000 g離心30 s，棄去上清；13)室溫10 000 g離心MB Spin Filter 1 min，并小心轉(zhuǎn)移MB Spin filter到2 mL Collection Tube中，盡量避免Solution C5污染；14)加入100 μL Solution C6到白色濾膜中心，室溫10 000 g離心30 s；15)棄去Spin Filter。此時收集管中的DNA可立即進(jìn)行PCR的使用或者儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物設(shè)計 對GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中細(xì)粒棘球絳蟲G1-G10型線粒體全基因組序列進(jìn)行比對，篩選出可擴(kuò)增ND6全基因的保守區(qū)域以設(shè)計合適的引物。上游引物A1：5′-TTTCGTGCTGTAGATGGT-3′，下游引物A2：5′-CACAGATTTCAAAGGGTT-3′，擴(kuò)增片段為558 bp。COX1基因片段序列(366 bp)擴(kuò)增引物，參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行設(shè)計。上游引物JB3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′，下游引物JB4.5：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′。2對引物序列均由生物生工工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.3ND6基因的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物A1、A2各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 8.7 μL，0.4% BSA 0.8 μL(BSA為穩(wěn)定劑)，輕輕混勻后瞬時離心15 s，同時，以ddH2O代替模板DNA作空白對照。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 45 s，58.5 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。平行試驗重復(fù)3次。

1.3.4測序鑒定 使用膠回收試劑盒收集PCR陽性產(chǎn)物純化，產(chǎn)物直接送生物生工工程(上海)股份有限公司測序，應(yīng)用DNAMAN軟件對測序序列和參照序列進(jìn)行多重比較和相似性分析。

1.3.5ND6基因的特異性測定 在相同條件下對多房棘球絳蟲、孟氏迭宮絳蟲、豆?fàn)顜Ы{蟲、犬復(fù)孔絳蟲、多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲及犬弓首蛔蟲的ND6基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。

1.3.6ND6基因的靈敏度測定 利用Thermo Scientific NanoDrop 分光光度計(Thermo, New York, USA)測定細(xì)粒棘球絳蟲模板DNA的初始濃度，之后將提取出的模板DNA按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000倍比稀釋，并在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1 %瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。

1.3.7人工感染細(xì)粒棘球絳蟲犬糞樣的ND6基因檢測 對2只犬(1號犬、2號犬)人工感染原頭蚴第3 d至第18 d后的糞便依次進(jìn)行DNA提取，并利用PCR擴(kuò)增ND6基因，1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。

1.3.8ND6基因與COX1基因作為分子標(biāo)記的犬糞樣臨床檢測比較 對40份隨機(jī)采自包蟲病流行區(qū)的待檢犬糞進(jìn)行DNA提取，并對ND6完整基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時擴(kuò)增COX1部分基因序列，1 %瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。對PCR結(jié)果呈陽性的樣品使用柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA的回收純化, 回收產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，以保證所測序列的準(zhǔn)確性。將ND6和COX1測序后的基因序列與GenBank檢索的10個基因型的線粒體DNA序列相應(yīng)區(qū)域做同源性比較，鑒定樣品基因型。另外，對5份自然感染豆?fàn)顜Ы{蟲的犬糞、5份自然感染的多頭帶絳蟲犬糞及2份自然感染的泡狀帶絳蟲犬糞樣品擴(kuò)增ND6基因，1 %瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)粒棘球絳蟲18 d齡童蟲ND6基因的PCR擴(kuò)增 用合成的引物A1、A2，對從實驗室人工感染犬的腸道獲得的細(xì)粒棘球絳蟲蟲體(18日齡童蟲)提取DNA并擴(kuò)增出了完整的ND6基因，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符合，且條帶清晰。陰性對照無任何條帶(圖1)。

M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 蟲體DNA；2: 陽性對照；3: 陰性對照圖1 細(xì)粒棘球絳蟲蟲體ND6基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 ND6 PCR amplification from DNA samples obtained from the E.granulosus

2.2ND6基因的特異性測定 細(xì)粒棘球絳蟲DNA樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生單一目的條帶，而多房棘球絳蟲、孟氏迭宮絳蟲、豆?fàn)顜Ы{蟲、犬復(fù)孔絳蟲、多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲及犬弓首蛔蟲的DNA樣本和陰性對照均無此擴(kuò)增條帶(圖2)。

M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 細(xì)粒棘球絳蟲DNA；2：多房棘球絳蟲DNA；3: 多頭帶絳蟲DNA；4: 孟氏迭宮絳蟲DNA；5: 豆?fàn)顜Ы{蟲DNA；6: 泡狀帶絳蟲DNA；7: 犬復(fù)孔絳蟲DNA；8：犬弓首蛔蟲DNA；9：陰性對照圖2 ND6基因的特異性測定Fig.2 Specificity test of the ND6 gene

2.3ND6基因的靈敏度測定 經(jīng)測定,細(xì)粒棘球絳蟲模板初始DNA含量為273 ng，隨著稀釋度的增加，模板中DNA的含量越來越低，且電泳條帶亮度在逐漸減弱，在稀釋度為1/64 000即(4 pg)時能擴(kuò)增到一條很淡的條帶，但在稀釋度為1/128 000(即2 pg)時無條帶擴(kuò)增出(圖3)。

M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 1; 2: 1/10; 3: 1/100; 4: 1/1 000; 5: 1/2 000; 6: 1/4 000; 7:1/8 000; 8:1/16 000;9: 1/32 000;10: 1/64 000;11:1/128 000圖3 ND6基因的靈敏度測定Fig.3 Sensitivity test of the ND6 gene

2.4人工感染細(xì)粒棘球絳蟲犬糞樣的ND6基因檢測 經(jīng)測定，在感染細(xì)粒棘球絳蟲第3 d至11 d時，2只犬糞便的ND6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。在第12 d時，只有2號犬的ND6基因PCR結(jié)果為陽性，而感染第13 d至18 d時，兩只犬ND6基因PCR結(jié)果均出現(xiàn)陽性目的條帶(圖4)。

2.5ND6基因與COX1基因作為分子標(biāo)記的犬糞樣臨床檢測比較 對40份臨床犬糞進(jìn)行PCR檢測后，有6份犬糞樣品為PCR陽性，且ND6基因及COX1基因的檢測及分型結(jié)果均相同，即6份樣品均屬G1基因型。而對5份自然感染豆?fàn)顜Ы{蟲的犬糞、5份自然感染的多頭帶絳蟲犬糞及2份自然感染的泡狀帶絳蟲犬糞進(jìn)行PCR檢測擴(kuò)增ND6基因時，無樣品呈現(xiàn)擴(kuò)增性條帶(圖5a-5c)。

M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 3-18: 人工感染第3 d至第18 d的犬糞DNA圖4 1號犬與2號犬糞便樣品的ND6基因檢測Fig.4 PCR amplification of ND6 gene in faeces samples of No. 1 dog and No. 2 dog

M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-6：陽性犬糞DNA圖5a 6份陽性犬糞DNA的ND6基因檢測Fig.5a ND6 PCR amplification of 6 positive canine faeces DNAM: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-6：陽性犬糞DNA圖5b 6份陽性犬糞DNA的COX1基因檢測Fig.5b COX1 PCR amplification of 6 positive canine faeces DNAM: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1：陽性對照；2-6: 豆?fàn)顜Ы{蟲犬糞DNA;7-11: 多頭帶絳蟲犬糞DNA；12-13: 泡狀帶絳蟲犬糞DNA圖5c 對照組臨床犬糞的ND6基因檢測Fig.5c ND6 gene’s amplifying results of the control group of clinical canine faeces by PCR

3 討 論

檢測犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的傳統(tǒng)經(jīng)典方法主要有：剖檢法、檳榔堿瀉下法和蟲卵漂浮檢查法。但是這些方法費時費力、易漏檢、且生物危害性較大[15]。糞抗原ELISA檢測法簡單易行，特異性可高達(dá)97%[16-17]。但其敏感性易受感染程度的影響，當(dāng)感染蟲體數(shù)在100條以下時，其敏感性只有29%[18-20]。此外，該法在帶科絳蟲種屬相近的蟲體之間可能會出現(xiàn)嚴(yán)重的交叉反應(yīng)[21]，因此，糞抗原ELISA法檢測結(jié)果可能出現(xiàn)較高的假陽性。LAMP技術(shù)所需設(shè)備簡單，反應(yīng)快速，產(chǎn)物檢測便捷，特異性強(qiáng)[22-25]，且Bst DNA聚合酶的活性幾乎不受糞便抑制物的影響[24-26]。但因其靈敏度過高，少量的基因污染就會導(dǎo)致該法實驗結(jié)果呈假陽性[27]；且由于LAMP法的電泳圖為多條帶，故不易辨認(rèn)非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生[28]，也無法通過基因測序而進(jìn)行基因分型分析。另外，該法要求靶序列長度控制在300 bp以下，對引物要求較高，要篩選出合適的引物需要耗費大量的工作[29]。

動物糞便易于收集保存且糞便中感染源的數(shù)量龐大，其病原體遺傳物質(zhì)可以來源于寄生蟲的蟲卵，或寄生蟲蟲體的細(xì)胞及組織碎片等，僅用少量的糞便即可提取到目的基因[30]，因此糞便PCR檢測法也逐漸成為了檢測動物疾病的重要途徑。相比于病原學(xué)檢測和免疫學(xué)檢測方法，PCR檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、敏感、特異等優(yōu)點，也可實現(xiàn)對形態(tài)難以區(qū)分的帶科絳蟲的鑒定[31-32]。自Bretagne等[33]報道用PCR技術(shù)從狐貍糞DNA中檢測多房棘球絳蟲感染之后，該技術(shù)在犬糞棘球絳蟲卵檢測中也得到廣泛的應(yīng)用。Dinkel等[16]應(yīng)用巢式PCR檢測法對多房棘球絳蟲12S rRNA片段(373 bp)進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果最低檢測到1個蟲卵，而細(xì)粒棘球絳蟲等11種其他絳蟲均無非特異性擴(kuò)增，特異性為100%。Abbasi等[34]對目標(biāo)重復(fù)序列(EgG1 Hae III)(133 bp)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其敏感度很高，最低也可檢測出一個蟲卵。但其特異性較差，同時擴(kuò)增的水泡帶絳蟲、多頭帶絳蟲、羊帶絳蟲也具有相同的133 bp DNA重復(fù)序列[35]。Stefania等[36]對細(xì)粒棘球絳蟲G1株的12S rDNA片段(255 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，敏感性達(dá)到對一個蟲卵的檢測，同時對細(xì)粒棘球絳蟲另外5種基因型和其它14種絳蟲基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果僅特異性的擴(kuò)增出細(xì)粒棘球絳蟲G1型，檢測結(jié)果無假陽性。此外，Dinkel 等[37]還根據(jù)細(xì)粒棘球絳蟲G1株線粒體12S rRNA基因序列(254 bp)設(shè)計引物，鑒別了絳蟲不同屬和細(xì)粒棘球絳蟲不同基因型(共16種)，其特異性達(dá)100%，同時其敏感度也達(dá)到0.25 pg的DNA含量。但是，以上PCR檢測的研究中，所選用的靶基因均為較短片段，所包含的遺傳信息有限，不宜作為分子遺傳標(biāo)記。

本研究中，我們首次建立了一種糞便PCR方法，可同時對細(xì)粒棘球絳蟲進(jìn)行檢測及基因分型研究。在我國，犬小腸內(nèi)寄生的絳蟲除細(xì)粒棘球絳蟲外，最常見的還有多房棘球絳蟲、多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲、豆?fàn)顜Ы{蟲、犬復(fù)孔絳蟲、孟氏迭宮絳蟲。另外，犬弓首蛔蟲也是很常見的犬腸道寄生蟲。本實驗分別對以上8種寄生蟲進(jìn)行了PCR檢測，結(jié)果表明除細(xì)粒棘球絳蟲外均未擴(kuò)增出目的條帶，說明本方法設(shè)計的引物具有高度的種特異性，不會發(fā)生交叉反應(yīng)。而在測定本方法的靈敏度時，將目的基因按比例稀釋(273 ng～2 pg)，結(jié)果表明隨著DNA濃度的逐漸降低，目的條帶亮度也在逐漸減弱直到稀釋至4 pg后陽性條帶才完全消失，這就表明該方法具有較高的靈敏度。Alsabi等[38]曾采用蟲卵漂浮法、糞抗原ELISA法、糞便PCR法及蟲卵PCR法對感染多房棘球絳蟲的不同時期進(jìn)行檢測，最終認(rèn)為在潛伏期(感染2 d～29 d)時，糞抗原ELISA檢測法最敏感，遠(yuǎn)高于糞便PCR法的敏感性。但是在本研究中，當(dāng)犬人工感染約50 000只原頭蚴時，建立的糞便PCR法在感染后第13 d便可從犬糞中擴(kuò)增出目的基因，表明該法能夠在早期診斷出犬細(xì)粒棘球絳蟲的感染情況，適用于在細(xì)粒棘球絳蟲感染潛伏期進(jìn)行診斷。

目前，根據(jù)mtDNA基因的不同[14, 39-44],可將細(xì)粒棘球絳蟲分為10個不同的地理株 (G1～G10), 其中線粒體基因COX1(366 bp)基因片段是經(jīng)典常用的基因分型方法之一。本研究中，我們利用ND6基因?qū)ψ匀桓腥炯?xì)粒棘球絳蟲的陽性犬糞進(jìn)行了基因分型，其分型結(jié)果與COX1基因的結(jié)果完全一致，均為G1型。結(jié)果表明我們所擴(kuò)增的ND6全基因序列，不僅可以作為分子診斷標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測，而且其還可作為分子遺傳標(biāo)記，對細(xì)粒棘球絳蟲進(jìn)行進(jìn)一步的基因分型及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析。

糞便PCR檢測法雖有大量的優(yōu)點，但糞便中較多干擾因素的存在使目的基因的提取難度相對增大[45]，同時也使PCR檢測結(jié)果受到很大影響。據(jù)報道用0.4%～0.6%(wt/vol)的BSA可提高Taq聚合酶的活性，降低糞便抑制劑的作用，增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的敏感性，因此我們在PCR體系中加入0.4% BSA，明顯地提高了PCR反應(yīng)結(jié)果質(zhì)量[46]。

4 結(jié) 論

本試驗成功建立了一種基于線粒體ND6基因檢測犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的糞便PCR方法，具有很高的特異性和靈敏度，并能夠在感染早期及時檢測出犬糞便中的細(xì)粒棘球絳蟲，可用于犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的流行病學(xué)調(diào)查。同時，對于PCR檢測陽性者，其膠回收產(chǎn)物經(jīng)測序分析后也可用于細(xì)粒棘球絳蟲基因分型及種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析研究。

利益沖突：無

引用本文格式：詹佳飛，宋宏宇，王凝，等.基于線粒體ND6基因檢測犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的糞便PCR方法[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35(7)：626-632. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.67