醒脾解郁湯對肝部分切除老年小鼠認知功能和神經元損傷的影響

李秀菊， 高源， 趙雪， 王領， 宗傳赪

（武漢市第八醫院麻醉科，湖北武漢 430010）

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指術后學習能力、記憶力、執行力以及認知能力等受到損傷。大多數患者可在術后3個月后恢復，極少數患者為永久性認知功能障礙，是老年患者最為常見的術后中樞神經系統并發癥，對術后康復以及生活質量產生嚴重影響[1，2]。以往研究報道術后早期的POCD與細胞因子介導的炎癥反應、氧化應激、神經元凋亡以及中樞神經系統退行性等密切相關，臨床上尚缺乏有效的治療藥物[3]。醒脾解郁湯是基于對認知功能障礙肝郁脾濕病機的認識而擬定的有效方劑。本研究通過觀察醒脾解郁湯對模擬POCD的肝部分切除老年小鼠模型的學習記憶行為和細胞凋亡以及神經細胞標志物表達的影響，探討醒脾解郁湯對POCD的影響及其分子機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半，鼠齡18個月，體質量30～35g，購自湖北省疾控中心。動物質量合格證號：42816300002523。于華中農業大學完成實驗。所有小鼠適應性喂養1周后開始實驗。實驗過程中小鼠的處理嚴格遵循動物福利與倫理準則和指南的相關規定。所有小鼠被隨機分為5組，即假手術組、肝切除組及醒脾解郁湯低、中、高劑量組，每組8只。

1.2 藥物、試劑與儀器 醒脾解郁湯由石菖蒲10 g、西洋參15 g、郁金12 g、熟地黃15 g組成，各中藥材購自湖北天濟中藥飲片有限公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量試劑盒和RIPA裂解液（武漢Bio-swamp公司）；兔抗caspase 3多克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗神經元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）多克隆抗體和兔抗膠質纖維酸性蛋白（gelatinous fiber acid protein，GFAP）單克隆抗體（英國Abcam公司）；兔抗GAPDH多克隆抗體（美國Proteintech公司）。SMART 3.0小動物行為視頻分析系統（西班牙PANLAB公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司）；Tanon-5200全自動化學發光分析儀（上海天能公司）。1.3 模型建立 根據文獻[4，5]方法建立肝葉部分切除術小鼠模型。具體步驟：肝切除組，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠給予腹腔注射0.2 mg/kg芬太尼和5 mg/kg氟哌利多，待小鼠的翻正反射消失后進行固定。對小鼠腹部進行消毒，在劍突下切開2 cm，打開小鼠腹腔分離其肝臟左外側葉，用7號絲線在遠端蒂部進行結扎，將結扎外側的肝臟組織切除，徹底止血后用3號絲線對切口進行逐層縫合，并進行常規消毒。假手術組小鼠進行手術但不切除肝葉。

1.4 給藥 醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠于術前6 d開始至術后2 d每天分別灌胃3.6、7.2、14.4 g·kg-1·d-1的醒脾解郁湯，假手術組和肝切除組小鼠灌胃等體積生理鹽水。藥物劑量換算根據文獻[6]計算得出。

1.5 水迷宮實驗 所有小鼠于術前6 d開始進行水迷宮訓練，每天4次。每次讓小鼠面向池壁入水，令其尋找置于第Ⅰ象限水面下1 cm處的平臺，所耗時間記為逃逸潛伏期。本實驗設定最大時限為90 s（即在90 s內未找到平臺者停止記錄，并將逃逸潛伏期記為90 s）。術后第2天撤去平臺，選取原平臺正對象限為動物入水點，讓動物自由游泳90 s，記錄90 s內動物穿過平臺區的次數，并記錄逃逸潛伏期。

1.6 Western Blot實驗 對各組小鼠的海馬組織進行蛋白提取，采用BCA法進行蛋白濃度測定。每孔上樣30 μL蛋白樣品，12%的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉印至PVDF膜上。0.5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌后分別加入一抗（caspase 3稀釋比：1∶500；Bax稀釋比：1∶2 000；Bcl-2稀釋比：1∶2 000；NeuN稀釋比：1∶1 000；GFAP稀釋比：1∶10 000），4℃孵育過夜。TBST再次洗滌后，加入HRP標記的特異性二抗IgG室溫孵育1 h，洗膜。ECL化學發光試劑曝光顯影，拍照保存。

1.7 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組的組間比較采用單因素方差，均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 醒脾解郁湯對肝部分切除老年小鼠認知功能的影響 表1結果顯示：手術后第2天，與假手術組小鼠比較，肝切除組小鼠的逃逸潛伏期明顯延長，小鼠穿越平臺的次數減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與肝切除組小鼠比較，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠的逃逸潛伏期顯著縮短，小鼠穿越平臺的次數顯著增多，且呈劑量依賴性。

表1 醒脾解郁湯對肝部分切除老年小鼠認知功能的影響Table 1 The effect of SDD on the cognitive function of aged mice with partial hepatectomy （±s）

表1 醒脾解郁湯對肝部分切除老年小鼠認知功能的影響Table 1 The effect of SDD on the cognitive function of aged mice with partial hepatectomy （±s）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與肝切除組比較；③P＜0.05，與醒脾解郁湯低劑量組比較

穿臺次數（n/次）8.51±0.73 4.22±0.65①5.91±0.67①6.46± 0.82①②7.57± 0.97②③組別假手術組肝切除組醒脾解郁湯低劑量組醒脾解郁湯中劑量組醒脾解郁湯高劑量組N88888逃逸潛伏期（t/s）27.57±4.54 39.18±3.76①35.79±3.87①33.09± 3.72①②30.71± 3.83②③

2.2 醒脾解郁湯對肝部分切除老年小鼠凋亡相關蛋白的影響 圖1結果顯示：與假手術組比較，肝切除組小鼠海馬組織中Bax、caspase 3蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。與肝切除組比較，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.3 醒脾解郁湯對肝部分切除老年小鼠NeuN、GFAP蛋白表達的影響 圖2結果顯示：與假手術組比較，肝切除組小鼠海馬中NeuN蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），GFAP蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與肝切除組比較，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠海馬組織中NeuN蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），GFAP蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

3 討論

醒脾解郁湯中的石菖蒲、西洋參、郁金和熟地黃是治療認知障礙的常用中藥，在治療多種類型認知障礙疾病中具有較好的療效[7，8]。本研究采用國內外認可的Morris水迷宮實驗[9]評價醒脾解酒湯肝部分切除老年小鼠的空間學習能力以及記憶能力，結果表明，醒脾解郁湯干預能夠顯著縮短肝部分切除老年小鼠的逃逸潛伏期，增加穿臺次數，提示醒脾解郁湯能有效改善肝部分切除術后小鼠的認知功能障礙。

POCD的具體發生機制尚未完全明確，但已有研究顯示其發生可能與海馬神經元凋亡密切相關。海馬是中樞神經系統內與學習記憶能力等認知功能密切相關的重要部位，海馬神經元凋亡增加是機體認知功能障礙的機制之一[10，11]。NeuN是神經元特異性標志物，是一種表達在神經系統大多數神經元胞核和胞漿中的特異性蛋白質[12]。GFAP是星形膠質細胞中最重要的骨架蛋白，其表達的強弱代表星形膠質細胞的功能狀態，被認為是星形膠質細胞的特異性標記物[13]。星形膠質細胞參與組成細胞骨架，在大腦的神經發育中對神經元遷移具有引導作用，對神經元分化具有促進作用，可分泌多種生長因子和神經營養因子，對神經元具有支持和營養的作用，同時還可以通過調劑細胞內外離子平衡加強受損神經元的修復和再生，并對神經元的興奮性具有調節作用。中樞神經系統損傷時，GFAP呈現上調趨勢[14，15]。Bcl-2和Bax是細胞凋亡中的2個關鍵因子，它們分別是抑制和促進細胞凋亡的調控基因[16]。caspase 3被認為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關鍵蛋白酶[17]。本研究結果顯示不同劑量醒脾解郁湯可顯著降低肝切除術后小鼠海馬組織中Bax、caspase 3和GFAP蛋白表達水平，顯著升高Bcl-2和NeuN蛋白表達水平，且呈劑量依賴性，表明醒脾解郁湯可減少肝切除老年小鼠海馬中細胞凋亡以及增加海馬中神經元。

圖1 各組小鼠海馬組織中Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白的表達Figure 1 Comparison of the expression levels of caspase 3，Bax and Bcl-2 proteins in mouse hippocampus of various groups

圖2 各組小鼠海馬組織中NeuN和GFAP蛋白的表達Figure 2 Comparison of the expression levels of NeuN and GFAP proteins in mouse hippocampus of various groups

綜上所述，醒脾解郁湯可通過減少肝切除老年小鼠海馬中細胞凋亡以及增加海馬中神經元來減輕其術后導致的認知功能障礙。