針刀松解法對腰椎間盤突出癥根性神經痛模型大鼠鎮痛與抗炎效果分析

馮濤， 張麗萍

（1.菏澤市中醫醫院，山東菏澤 274000；2.山東中醫藥大學附屬威海醫院，山東威海 264200）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是腰腿痛最為常見的原因，是臨床常見病，好發于30～50歲的體力勞動者或者平時缺乏鍛煉的人群[1]。腰椎間盤突出等一系列的脊柱退行性病變均會對神經根造成不同程度的壓迫，進而導致神經損傷并誘發神經傳導阻滯，臨床表現為慢性腰背痛與坐骨神經痛等癥狀，本病的根本病理變化在于病變部位神經根的損傷。而病變部位發生周圍神經損傷之后，會造成背根結神經細胞凋亡增多，這種異常的神經細胞凋亡會影響到患者后期生理功能的恢復[2-4]。所以，在治療過程中，減少神經損傷之后出現背根神經節神經元凋亡，具有十分重要的臨床意義。本實驗以腰椎間盤突出癥根性神經痛模型大鼠為研究對象，通過針刀松解法治療后，檢測各組大鼠脊髓谷氨酸（Glu）、脊髓背角P物質（SP）、下丘腦β-內啡肽（β-EP）、血清白細胞介素1β（IL-1β）含量的變化，探討針刀松解法對腰椎間盤突出癥根性神經痛模型大鼠鎮痛、抗炎效果與機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠40只，雄性，體質量240～270 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（京）2016-0003，飼養于北京中醫藥大學基礎醫學院實驗動物中心二級實驗室，室溫維持在20℃。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛，北京化學試劑廠，批號：160902；碘伏，武漢同濟美迪生科技有限公司，批號：20160802；酒精，北京貞玉民生藥液有限公司，批號：201607002；谷氨酸ELISA試劑盒、β-內啡肽ELISA試劑盒、白細胞介素-1β ELISA試劑盒和P物質ELISA試劑盒，均由北京尚柏生物科技有限公司提供。HZ系列一次性針刀規格為0.4 mm×40 mm，漢章牌，北京卓越華友醫療器械有限公司；LH202H型韓氏穴位神經刺激儀，北京華衛產業發公司；環球牌無菌針灸針，規格為0.2 mm×13 mm，蘇州針灸醫療器材有限公司；5415R型高速離心機，德國Eppendorf公司；FS/FAS5030石蠟切片機，德國LETIZ公司；BX61顯微鏡，日本Olympus株式會社；PL-200型熱痛測試儀檢測盒，成都泰盟軟件有限公司。

1.3 分組與模型制備[5]

大鼠適應性喂養3 d后，隨機分為正常組、模型組、針刀組和電針組，共4組，每組各10只。除正常組外，其余各組大鼠用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）進行腹腔麻醉，背部脫毛之后以俯臥位固定在鋪有無菌手術巾的手術臺上面；將手術區域暴露出來，用碘伏對大鼠暴露的手術部位進行消毒處理；將L3-4棘突作為中心區域，于大鼠背部正中部位取大約3 cm長的切口，依次切開大鼠背部的皮膚、皮下組織與腰背筋膜層；將其背部組織進行鈍性分離，直至暴露腰椎旁肌；將其牽開后，用微型咬骨鉗將左側L4棘突及右側椎板、關節突咬除，暴露L4神經根，以4-0鉻制腸線環扎在L4神經根處，其松緊度以腸線接觸到神經根但無明顯壓迫為宜。將切口進行逐層地縫合，并灑上青霉素粉末，術后3 d內每天給予大鼠青霉素肌注預防感染，劑量為8萬U/d。

待大鼠清醒后，觀察大鼠雙下肢是否有癱瘓的情況出現（主要表現為步態不穩或者足外翻），以此來判定造模是否對大鼠造成了脊髓的損傷。如果沒有癱瘓的情況，就對大鼠兩側的后足檢測熱刺激痛覺過敏情況：將大鼠放置在PL-200型熱痛測試儀的檢測盒之中，輻射熱光源經過底部的玻璃板聚焦于大鼠一側足底的后半部位，其光斑直徑為5 mm。把大鼠從開始照射到產生縮爪的時間記錄下來。每次測試間隔至少為5 min，測量3次取其平均值，對大鼠的兩側后足進行交替檢測。根據各次檢測的平均值求出大鼠兩后足進行熱刺激后發生縮爪的潛伏期，計算公式：縮爪的潛伏期=術前側潛伏期-術后潛伏期。差值比正常組大鼠的差值大則說明潛伏期下降，對熱痛反應發生了痛覺過敏現象，提示造模成功。

1.4 干預方法

正常組與模型組，均常規飼養。針刀組：造模3 d后，給予大鼠針刀干預治療。施行針刀時先用乙醚將大鼠麻醉1 min，選用HZ系列一次性針刀進行干預，其治療點選擇于患椎上下棘之間、患椎上下棘間旁開0.1 cm處，患椎上下橫突，臀上皮神經走行區域、坐骨神經出口處等部位的條索、結節、壓痛點等位置，每次選擇2-3個點進行松解。每周干預1次，共干預3次。電針組：造模3 d后，給予大鼠電針干預治療。取大鼠的環跳穴、委中穴。參考《實驗針灸學》[6]教材，并結合動物比較學方法進行取穴，依據比較解剖取穴法配合模擬骨度取穴法最終確定穴位的具體位置。選用一次性無菌針灸針，針刺后連接韓氏穴位神經刺激儀對大鼠進行電針刺激，頻率為2～100 Hz，電流強度以造成大鼠后肢輕度抖動為宜，每次刺激20 min。隔天治療1次，每周治療3次，共治療3周。

1.5 取材與檢測指標

實驗結束后24 h內取材，用10%水合氯醛溶液0.0375 mg/kg腹腔麻醉大鼠，快速取出其脊髓的L4-6段，分成2個部分。第一部分放置于液氮罐內凍存，以蔡堯輝毛細管電泳分析Glu含量的變化。第二部分放置于以4%多聚甲醛為主要成分的固定液中固定6～12 h后，梯度酒精脫水處理，用二甲苯進行透明處理；石蠟包埋后，作連續冠狀切片，厚度約為5 μm，用于免疫組織化學方法分析SP含量的變化。

實驗結束后，大鼠斷頭取血6 mL，4℃，離心機3 000 r/min離心15 min后，進行血清分離，放射免疫法進行大鼠IL-1β含量的測定。

快速分離大鼠腦組織，冰盤上分離出大鼠下丘腦，制成腦勻漿，以放射免疫法對大鼠下丘腦β-EP的含量進行測定。

1.6 統計方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，運用單因素方差分析，等級資料應用Ridit分析。組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）。當方差分析有顯著意義時，進行多組間兩兩比較；在方差齊時采用Bonferroni法，而方差不齊時采用Tamhane法。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠脊髓Glu毛細管電泳比較

表1結果顯示：模型組大鼠脊髓Glu的含量明顯上升，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；電針組和針刀組大鼠脊髓Glu的含量明顯下降，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠脊髓Glu毛細管電泳比較Table 1 Comparison of the content of spinal Glu in various groups[±s，c/（μmol·L-1）]

表1 各組大鼠脊髓Glu毛細管電泳比較Table 1 Comparison of the content of spinal Glu in various groups[±s，c/（μmol·L-1）]

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組電針組針刀組Glu 64.12±10.68 113.62±18.26①66.72±11.93②65.37±10.01②N 10 10 10 10

2.2 各組大鼠SP免疫組化結果比較

正常組大鼠P物質的免疫陽性反應物主要集中在脊髓的Ⅰ～Ⅱ層，模型組大鼠脊髓Ⅰ～Ⅳ層都能看到陽性反應物，見圖1。模型組積分光密度升高，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；電針組與針刀組積分光密度明顯改善，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠SP免疫組化結果比較Table 2 Comparison of the SP immunohistochemical results in various groups （±s）

表2 各組大鼠SP免疫組化結果比較Table 2 Comparison of the SP immunohistochemical results in various groups （±s）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組電針組針刀組積分光密度10.98±1.52 33.85±8.03①26.54±6.86②24.61±3.42②N 10 10 10 10

圖1 各組大鼠P物質的免疫陽性反應物（免疫組化，×100）Figure 1 Comparison of the positive immune reactants of substance P in various groups（by immunohistochemical method，×100）

2.3 各組大鼠下丘腦β-EP及血清IL-1β含量比較

表3結果顯示：模型組大鼠下丘腦中β-EP及血清IL-1β的含量均明顯升高，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。電針組與針刀組大鼠下丘腦中β-EP及血清IL-1β的含量均明顯降低，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表3 各組大鼠下丘腦β-EP及血清IL-1β含量比較Table 3 Comparison of the contents of hypothalamic β-EP and serum IL-1β in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表3 各組大鼠下丘腦β-EP及血清IL-1β含量比較Table 3 Comparison of the contents of hypothalamic β-EP and serum IL-1β in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組電針組針刀組IL-1β 0.41±0.06 0.71±0.42①0.44±0.32②0.42±0.06②N 10 10 10 10 β-EP 104.31±45.63 172.13±40.76①112.72±26.65②110.15±28.69②

3 討論

針刀療法是一種治療慢性軟組織損傷的新療法，其將傳統針灸方法與西醫外科手術刀相結合，能夠松解黏連、刮除瘢痕、消除痙攣，恢復軟組織的動態力學平衡。電針是一種對傳統針灸學的繼承與發揚，它結合了針與電兩種刺激手段，能夠有效地提高臨床療效，且可以較為準確地掌握刺激參數，并代替了手法運針，節省人力，故目前廣泛地應用于針灸治療當中。

谷氨酸（Glu）廣泛存在于中樞神經系統之中。研究[7]發現，Glu能夠促進炎性痛敏的發生，且對痛敏的維持起到關鍵的作用，如果抑制Glu釋放或者拮抗Glu與其相應的受體發生結合都能夠有效地抑制痛敏的形成，明顯減輕疼痛反應。本實驗結果表明，模型組大鼠脊髓中Glu的含量較正常組明顯上升，這表明Glu在痛敏及突觸可塑性改變過程中起著極為重要的作用，這與之前的研究結果基本一致；而電針或者針刀刺激能夠使脊髓Glu的含量有所下降，提示脊髓Glu含量的降低很可能是電針或者針刀鎮痛的機制之一。

P物質（SP）及其受體廣泛分布于脊髓的Ⅰ層、Ⅱ層與Ⅹ層，并參與疼痛信息的傳遞[8，9]。通過細胞毒的作用，使脊髓背角表達SP受體的神經元有所減少，能夠有效地抑制脊髓背角細胞的中樞敏化，這意味著SP是影響痛敏形成與發展的主要因素[10]。本實驗結果顯示，模型組大鼠脊髓中SP的免疫陽性反應初級傳入纖維末梢和背角神經元釋放的SP增多，而電針組和針刀組SP的積分光密度較模型組明顯下降，說明電針或者針刀對于炎性痛的環節很可能是通過抑制脊髓背角中SP的釋放以阻斷痛覺信號的傳遞來實現的。

β-內啡肽（β-EP）是由其自身合成的具阿片樣作用的肽類物質，是機體鎮痛系統的主要遞質，可以在中樞與外周兩處位置發揮作用[11]。在中樞神經系統中，β-EP通過β-內啡肽能神經元的神經纖維投射到其相應核團部位以抑制疼痛信息的傳遞，比如脊髓背角痛覺信息傳遞的抑制作用；在外周，因為垂體與免疫細胞能夠分泌大量的β-EP入血，這主要通過損傷應激組織以緩解疼痛的發生。研究[12]發現，β-EP的鎮痛作用主要是通過含β-EP的免疫細胞遷移到炎癥組織中，促進β-EP的釋放，以激活感覺神經元周圍末梢上的阿片受體而發生鎮痛效果。本實驗結果顯示，電針或者針刀刺激都能夠使下丘腦β-EP的含量顯著下降，提示經過電針或者針刀治療，大鼠病變局部的血液循環得到了改善，其神經根的水腫與脫髓鞘變化有所緩解，在病變過程中多種炎癥介質的釋放有所減少，組織間的代謝得到了加快，這使得炎性物質的轉運與降解加速，這一過程與整個神經—內分泌—免疫網絡發生協同作用，從而降低了β-EP的含量。

白細胞介素-1β（IL-1β）是神經與免疫系統之間較為重要的一種傳遞物質，在神經與免疫系統之間起著重要的調節作用，所以被稱作免疫神經遞質，同時，它也是炎癥形成的中心環節[13，14]。研究[15]發現，腰椎間盤突出組織當中IL-1β的含量與根性疼痛呈正相關。本實驗結果表明，經過電針或者針刀治療，大鼠血清IL-1β的含量較模型組顯著下降，提示電針或針刀對腰椎間盤突出所誘發的炎癥反應能夠起到有效的良性調節作用，治療后通過減少血清中IL-1β的表達，以使炎癥細胞的聚集、激活及炎癥介質的釋放有所減少，減輕白細胞和內皮細胞之間的黏附反應，使得白細胞浸潤情況的發生減少，以減緩炎癥反應的程度與進程，從而緩解疼痛的癥狀。

本實驗結果顯示，模型組大鼠脊髓Glu、脊髓背角SP、下丘腦β-EP、血清IL-1β的含量明顯升高，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；電針組與針刀組脊髓Glu、脊髓背角SP、下丘腦β-EP、血清IL-1β表達水平明顯下降，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。表明針刀和電針治療均可明顯改善腰椎間盤突出癥根性神經痛癥狀，且針刀效果略優于電針。

本實驗提示針刀松解法、電針療法對腰椎間盤突出癥根性神經痛有明顯的抗炎與鎮痛作用。針刀松解法治療腰椎間盤突出癥根性神經痛在局部松解作用的基礎上，還通過對神經根的直接刺激作用，經神經纖維的傳導，激發下丘腦—垂體—腎上腺軸的調節，從神經、體液、免疫三個方面共同作用，抑制或減少化學性致痛因子的釋放，同時加速血液循環促進致痛因子的代謝，加速神經水腫的吸收及無菌炎癥的消退，從而減輕疼痛刺激，緩解癥狀[16-18]。本研究以電針組進行對比，以神經電生理、疼痛物質變化為切入點，通過實驗探索針刀治療LDH的作用機制，進一步剖析了LDH發病機制、病理轉變，從而有針對性地指導和完善LDH的臨床診療方案，同時也為針刀治療LDH的作用機制提供了實驗支持，完善了其理論研究。