肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體對大鼠肝星狀細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

張石蕾，由淑萍，馬曉婷，馬 龍，趙 軍，劉 濤，*

(1.新疆醫科大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學護理學院基礎護理學教研室，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆維吾爾族自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

肝纖維化的發展和結局是一個復雜的過程，涉及實質和非實質肝細胞以及浸潤的免疫細胞。由于細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)蛋白質的產生、沉積增加而形成瘢痕的纖維反應是肝臟結構變化的關鍵步驟[1]。活化的肝星狀細胞(hepaticstellatecells，HSCs)轉為靜止狀態及其凋亡是逆轉肝纖維化的關鍵因素[2]。肉蓯蓉是常見的補益類中藥，因其療效切實，藥性溫和，自古就被視為強身壯體、滋補的中藥，有“沙漠人參”之佳譽。化學及藥理作用研究顯示肉蓯蓉苯乙醇總苷(Cistanchephenylethanoid glycosides，CPhGs)具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和免疫調節等多種生物功能，是肉蓯蓉發揮藥效的主要物質基礎之一[3]。本課題組前期實驗研究證實，CPhGs對改善肝功能、抗肝纖維化有顯著療效，且隨CPhGs濃度的增加，HSCs的凋亡率逐漸增高，呈現一定的劑量依賴關系[4]。目前許多已經被批準臨床應用的抗肝纖維化作用藥物，對晚期肝纖維化和肝硬化的治療效果不佳，因此，研發靶向高效、高純度、高穩定性、低免疫原性的抗肝纖維化藥物勢在必行。脂質體作為新型藥物載體，可以增加藥物透過細胞膜的能力，能夠迅速到達病灶且主要分布于肝臟，從而降低藥物毒性，其緩釋性更能夠增強藥物的作用濃度，延長作用時間，減少藥物用量，提高藥物療效[5-6]。因此，本實驗以脂質體為藥物載體包裹傳統中藥制成CPhGs脂質體，研究CPhGs脂質體對體外培養大鼠肝星狀細胞增殖、凋亡、周期的作用，并初步探討其相關的分子機制，旨在研究可能為臨床所用的抗肝纖維化的靶向藥物治療途徑，為進一步藥物開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HSCs，購于上海中喬新舟生物科技有限公司；胎牛血清，購于美國Gibco公司，-20℃分裝保存；雙抗(青霉素、鏈霉素)、DMEM高糖培養基、0.25%胰酶(1×)，均購于美國Hyclone公司；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒，均購于美國BD公司；四甲基偶氮唑鹽MTT、DMSO，均購于美國Sigma公司；兔抗β-actin多克隆抗體，購于北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

超凈工作臺，美國ThermoScientific公司；CK-40型熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；AEL-200型電子天平；TGL-16G型臺式低溫高速離心機；CO2細胞培養箱，英國NEWBRUNSWICKGalaxy?系列；全波長自動酶聯免疫反應檢驗測試儀，美國Thermo Scientific公司；低溫離心機，美國Sigma公司；數顯恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；脫色搖床，北京市六一儀器廠；電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；Westernblot使用的電源、電泳裝置及轉膜裝置，美國Bio-Rad公司；移液器，美國ThermoScientific公司；FluorChemE化學發光高靈敏凝膠成像儀，美國ProteinSimple公司。

1.3 CPhGs脂質體的制備

采用薄膜分散法制備CPhGs脂質體。稱取卵磷脂、DPPC、膽固醇(質量比 5mg∶10mg∶10mg)，溶于適量氯仿和甲醇混合溶劑中(V氯仿∶V甲醇=2∶1)，在49～50℃下旋轉使成膜狀，加入250μg/mL的苯乙醇總苷不斷旋轉水化，使磷脂膜轉入水中形成脂質體，將所得脂質體放入4℃冰箱中備用。所得脂質體用0.45μm的微孔濾膜擠壓4～5次，0.22μm的微孔濾膜擠壓18～20次，即得粒徑均勻的苯乙醇總苷脂質體。包封率(38.46±7.85)%；電位45mV；粒徑209 nm；載藥量(3.71±0.23)%。

1.4 細胞培養及分組

將復蘇的HSCs常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養在37℃、CO2體積分數為5%的厭氧培養箱中，待細胞貼壁率約為80%時即可傳代，復蘇后傳2～3代，待細胞狀態穩定后即可用于實驗。將HSCs分為4組：空白對照組(未加入受試物，只加培養液)、CPhGs脂質體低、中、高濃度(分別為7.36、14.72、29.45 μg/mL)處理組。

1.5 MTT法檢測CPhGs脂質體對HSCs增殖的影響

選擇對數生長期的細胞、棄去培養液，加入500 μL0.25%的胰酶進行消化，制備單細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個/mL后接種96孔板，每孔100μL，12h貼壁后，吸去上清液，加入含各濃度CPhGs脂質體藥物的完全培養基，每孔100μL，每個濃度設3個復孔。CPhGs脂質體藥物用完全培養基倍比稀釋成7.36、14.72、29.45μg/mL共3個濃度。分別于培養24、48、72h后加入5mg/mL的MTT20 μL，4h后吸去上清加入150μLDMSO，492nm處測定吸光度D(492)值，并計算其均值。

1.6 流式細胞術檢測CPhGs脂質體對HSCs凋亡的影響

HSCs按1×105個/mL的濃度接種至6孔板，分組情況同1.4，給予受試物24h后將細胞吸至15mL離心管，每孔加入500μL胰酶消化細胞，用對應的完全培養液終止消化，輕輕吹打孔里的細胞混勻，每孔加入2mLPBS沖洗細胞，將孔里的PBS移至15mL離心管，盡可能多收集孔里的細胞，1000r/min離心5 min后棄上清，加5mLPBS至15mL離心管沖洗細胞，重復1次。每個樣品加入100μL1×Binding Buffer，重懸細胞，將細胞移至1.5mLEP管，各樣品加AnnexinV、PE雙染，混勻避光放置30min后，分別加入400μLBindingBuffer，1h內上機檢測細胞凋亡率。

1.7 流式細胞術檢測CPhGs脂質體對HSCs周期的影響

HSCs按1×105個/mL的濃度接種至6孔板，細胞分組及處理同1.4。完成后逐滴加入5mL或更多預冷的75%的乙醇，渦旋以混勻細胞，4℃避光過夜(＞18 h)。1000r/min離心10min后棄上清，清洗細胞2次以去除所有的乙醇。分析前4℃避光保存樣本，1h之內采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.8 CPhGs脂質體對HSCs中caspase-3和p27蛋白表達的影響

HSCs按1×105個/mL的濃度接種至6孔板，分組情況同1.4，給予受試物24h后收集細胞，提取各組細胞中的總蛋白，上樣于聚丙烯酰胺凝膠進行還原性SDS-PAGE電泳，濕轉(PVDF膜)，200mA恒流電轉90min。封閉液(5%脫脂奶粉)封閉PVDF膜過夜，用1×TBST緩沖液充分振蕩清洗，TBST稀釋抗體，一抗濃度分別為 caspase-3(1∶1000)、p27(1∶1500)、β-actin(1∶5000)，ECL顯色。FluorChemE化學發光高靈敏凝膠成像儀上檢測條帶灰度值。

蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/內參條帶β-actin灰度值×100%

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 CPhGs脂質體對HSCs增殖的影響

采用MTT比色法檢測CPhGs脂質體對HSCs增殖的影響，結果見圖1。與空白對照組相比，CPhGs脂質體低、中、高即7.36、14.72、29.45μg/mL劑量組的細胞生長速度均明顯減慢(P＜0.05)。同一時間點，與空白對照組相比較，隨著藥物濃度升高，抑制細胞增殖作用增加(P＜0.05)；同一濃度組，隨時間延長，細胞活力不斷降低；且隨著時間以及藥物濃度的增加，抑制HSCs增殖能力不斷上升。提示CPhGs脂質體具有抑制HSCs增殖的作用。

2.2 CPhGs脂質體對HSCs凋亡的影響

7.36 、14.72、29.45μg/mL的CPhGs脂質體作用于HSCs24h后，早期凋亡與晚期凋亡的細胞總和分別為(18.5±2.7)%、(26.6±2.3)%、(31.6±1.9)%，與空白對照組的(5.0±0.9)%相比，差異均有統計學意義(P＜0.05)，結果見表1和圖2。分析表明CPhGs脂質體3個劑量組均可明顯誘導HSCs的早、晚期凋亡(與空白對照組比較，P＜0.05)，提示CPhGs脂質體可通過誘導HSCs凋亡，從而抑制HSCs的激活及肝纖維化的發生。

圖1 MTT法檢測CPhGs脂質體對HSC增殖的影響

表1 CPhGs脂質體各劑量組對HSCs細胞凋亡率的影響(n=3，)

表1 CPhGs脂質體各劑量組對HSCs細胞凋亡率的影響(n=3，)

與空白對照組比較，*P＜0.05

images/BZ_33_1273_1476_2297_1713.png

2.3 CPhGs脂質體對HSCs細胞周期的影響

細胞周期分析結果(表2和圖3)顯示，CPhGs脂質體各劑量組處理的HSCs，與空白對照組相比，G0/G1期的細胞比例均明顯增多(P＜0.05)，而S期細胞比例明顯減少(P＜0.05)，G2/M期細胞比例明顯減少(P＜0.05)。提示CPhGs脂質體可通過誘導細胞周期阻滯抑制HSCs增殖，CPhGs脂質體可引起細胞周期明顯阻滯。

表2 CPhGs脂質體各個劑量組對HSC周期的影響(%，n=3，)

表2 CPhGs脂質體各個劑量組對HSC周期的影響(%，n=3，)

與空白對照組比較，*P＜0.05.

images/BZ_33_1273_2325_2297_2561.png

2.4 CPhGs脂質體對大鼠肝星狀細胞caspase-3、p27蛋白表達水平的影響

Westernblot檢測結果見圖4。與正常對照組比較，CPhGs脂質體(29.45、14.72μg/mL)組大鼠肝星狀細胞caspase-3蛋白的表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；其中CPhGs脂質體29.45μg/mL濃度組上調作用最明顯(P＜0.05)；與空白對照組比較，CPhGs脂質體各劑量組p27蛋白的表達水平均明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；CPhGs脂質體29.45 μg/mL濃度組上調作用最明顯(P＜0.05)。

圖2 AnnexinV-FITC/PE雙染流式細胞術檢測CPhGs脂質體對HSCs細胞凋亡的影響

圖3 PE單染流式細胞術檢測CPhGs脂質體對HSCs細胞周期的影響

3 討論

肝纖維化是因ECM合成與降解失衡所致，是各種肝病發展為肝硬化的共同途徑。HSCs的激活是肝纖維化形成的中心環節，在肝損傷修復過程中發揮作用。肝損傷后，HSCs受各種致病因子刺激，從靜態轉化為具增生性、纖維原性和可收縮性的肌成纖維細胞，肌成纖維細胞產生大量ECM沉積于肝臟，最終導致肝纖維化。近年來研究發現，隨著肝星狀細胞數量的減少，肝纖維化程度可得到明顯改善[7-8]。因此，抗肝纖維化的藥物研究多數以肝星狀細胞為作用點尋找突破，經抑制炎癥反應，減少肝損傷因素如酒精藥物等，干擾相關細胞因子的活性調節和信號轉導的正常進行，以達到抑制肝星狀細胞活化及增殖，并誘導其凋亡，減少ECM生成，尋找能以HSCs為作用靶點，成為治療肝纖維化的重要策略[1]。

圖4 Westernblot檢測CPhGs脂質體處理HSCs后caspase-3、p27蛋白的表達水平

迄今為止，國內外的研究中，抑制HSCs活化并促進其凋亡、調節ECM的合成和降解等方面已取得一些成果，對肝纖維化的臨床治療提供了一些藥物和方法，但總體療效仍不理想。目前多認為，限制抗肝纖維化藥物效果的原因，可能與藥物無法達到靶細胞、或到達靶細胞但無法在其周圍形成有效的藥物濃度及半衰期短和藥物對其他組織細胞的副作用大過增加劑量帶來的療效等有關[9]。隨著肝臟疾病病死率的提高和中醫藥現代化進程的深入，中藥防治肝纖維化的機制研究越來越被人們所關注，可用于肝纖維化防治藥物的分子靶點也與日俱增[10]。肉蓯蓉(CistanchesHerba)為列當科植物肉蓯蓉(CistancheDeserticolaY.C.Ma)或管花肉蓯蓉[C.tubulosa(Schenk)Wight]的干燥帶鱗葉的肉質莖，作為滋補類傳統中藥在中國具有悠久的應用歷史化學作用及藥理作用[11]。課題組前期研究結果顯示，CPhGs可明顯抑制HSC的增殖，誘導其凋亡。且隨CPhGs濃度的增加，HSCs的凋亡率逐漸增高，預示其在治療肝臟疾病中有著廣闊的應用前景[12]。因此，研發靶向高效、高純度、高穩定性、低免疫源性的CPhGs勢在必行，同時應加強CPhGs抗肝纖維化機制的深入研究，為進一步可能的臨床研究提供最扎實的理論基礎。本實驗在體外水平研究3種不同劑量的CPhGs脂質體對HSCs增殖、凋亡、周期及相關蛋白表達的影響，探討CPhGs脂質體的抗肝纖維化機制，以期為肝纖維化的防治奠定基礎。

MTT檢測結果顯示，高、中及低劑量組CPhGs脂質體各濃度組24、48及72h均能抑制HSCs的增殖(P＜0.05)。

細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，細胞調亡是由基因調控的一種主動的細胞死亡過程，在某些生理或病理條件下，對維持機體正常的生理和功能活動具有重要的生物學意義[13]。Caspase蛋白家族成員組成凋亡通路的關鍵基因，細胞色素C是發現的第一種線粒體釋放促凋亡蛋白，是線粒體呼吸鏈的重要組成部分。細胞色素C使Apaf1寡聚化并能使caspase-9前體聚集，最終導致caspase-9前體水解形成活性酶。隨后caspase-9促使其他caspase酶(如caspase-7)的執行者即caspase-3前體轉換為有活性的caspase-3。Caspase-3是細胞凋亡早期一種非常重要的物質，被認為是執行酶中最為重要的一個，能夠被所有的起始凋亡蛋白酶活化，并降解細胞主要結構，最終瓦解細胞[14]。本次細胞凋亡檢測結果顯示，CPhGs脂質體3個劑量組均可明顯誘導大鼠肝星狀細胞的早、晚期凋亡(與空白對照組比較，P＜0.05)。蛋白水平檢測結果顯示，與正常對照組細胞相比，在CPhGs脂質體(29.45、14.72μg/mL)處理的細胞中，caspase-3蛋白水平表達顯著上調。這與細胞凋亡分析結果顯示的CPhGs脂質體處理的HSCs出現了明顯凋亡，證實CPhGs脂質體可能是通過上調caspase-3基因的表達而抑制細胞的增殖能力，從而誘導HSCs發生凋亡。

細胞周期分為分裂間期和分裂期，其中分裂期又可分為：DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)[15]。細胞周期的正常運行依賴于正、負調節因子的共同參與。正調節因子包括細胞周期蛋白(cyclin)和細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependentkinase，CDK)；負調節因子主要是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclindependentkinase inhibitor，CKI)。以上3種調控因子在維持細胞有序的增殖、分裂活動中起重要作用，三者相互作用，共同參與細胞周期調控[16]。p27屬于CKI，可通過抑制cyclin/CDK形成異二聚體結構，使細胞停滯于G1期，從而實現對細胞周期的調控功能[17]。細胞周期檢測結果顯示，CPhGs脂質體3個劑量組處理的HSCs，與空白對照組相比，G0/G1期的細胞比例均明顯增多(P＜0.05)，而S期細胞比例明顯減少(P＜0.05)，G2/M期細胞比例明顯減少(P＜0.05)，且呈一定的劑量依賴關系。與正常對照組細胞相比，在CPhGs脂質體(7.36、14.72、29.45μg/mL)處理的細胞中，p27蛋白水平表達顯著上調。這與細胞凋亡分析結果顯示的CPhGs脂質體處理的細胞出現明顯的G1期阻滯，S期和G2/M期細胞比例顯著減少是一致的。說明p27在CPhGs脂質體抑制HSCs增殖中可能具有重要作用。

本研究結果顯示，在細胞水平上，探討了CPhGs脂質體對HSCs的影響。將不同劑量的CPhGs脂質體藥物對HSC進行處理，CPhGs脂質體3個劑量組均可以抑制HSC的增殖，增加了HSC的凋亡，這一過程可能是通過激活以及caspase-3蛋白表達而引起細胞凋亡。此外，CPhGs脂質體可使HSC細胞周期更多地停滯在S期，可能的作用機制是影響了細胞周期蛋白p27蛋白的表達，從而抑制細胞周期的能力。提示細胞凋亡和細胞周期調節是CPhGs脂質體防治肝纖維化的兩個靶點，根據這一結論，可對細胞周期和凋亡相關的信號通道進行更深入的研究，進一步揭示CPhGs脂質體的抗纖維化機制，以達到靶向或抑制肝纖維化的目的。

(本實驗主要在新疆醫科大學中心實驗室完成，在此特別感謝實驗室的負責老師及研究生同學的支持與幫助)