鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯對小鼠睪丸損傷及p-CREB蛋白表達的影響

薄存香，張 玉，白 金，韓 茹，陳尚雅，賽林霖*

(山東省職業衛生與職業病防治研究院，山東第一醫科大學/山東省醫學科學院，山東 濟南 250014)

鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]屬于鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters，PAEs)化合物，是常用的塑化劑，因DEHP與塑料間是氫鍵或范德華力結合，易于擴散至周圍環境造成污染[1]。DEHP是一種典型的環境內分泌干擾物(environmentalendocrinedisruptors，EEDs)[2]，具有擬雌激素或抗雄激素作用[3-4]，可引起雄性動物生殖內分泌激素紊亂、睪丸萎縮、生精障礙等[5]，環磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)反應元件結合蛋白(cAMP-responseelementbindingprotein，CREB)信號通路是與精子發生密切相關的途徑之一[6]。本研究采用青春期雄性小鼠染毒DEHP，觀察其對睪丸的損傷及對睪丸組織中p-CREB蛋白表達的影響，探討DEHP的睪丸毒性及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DEHP(國藥集團化學試劑有限公司)，純度≥99.0%，溶劑為玉米油。p-CREB抗體購自美國CST公司，羊抗鼠IgG及DAB購自北京中杉金橋生物技術有限公司；HM325輪轉式切片機(Thermo)，YT-7FB攤烤片機、2T-12M組織脫水機、YT-6LF石蠟包埋機均購自湖北亞光醫用電子技術有限公司。OLYSIABioreport圖像拍攝系統，購于日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗動物及處理

選擇初斷乳雄性ICR小鼠40只，體質量16～18 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物合格證號SCXK(魯)20140007。按體質量隨機分為對照組(等體積玉米油)和DEHP染毒組(250、500、1000 mg/kg)，每組10只。經口灌胃，1次/天，6次/周，連續灌胃染毒8周，于末次染毒24h后處死。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 一般狀況觀察 每天觀察小鼠進食、飲水、行為活動、尿液、糞便等有無異常，每周稱量小鼠體質量一次。

1.3.2 睪丸、附睪臟器系數 分別處死各組小鼠后，迅速分離收集雙側睪丸和附睪，并按下式計算睪丸和附睪臟器系數。

1.3.3 精子計數 取各組小鼠雙側附睪尾稱取質量后，在4mL37℃生理鹽水中剪碎，4層擦鏡紙過濾，制成精子懸液，用血細胞計數板計數精子數。

1.3.4 睪丸組織病理學檢查 各組隨機選取3只小鼠的睪丸，以4%多聚甲醛溶液固定，常規病理切片，光鏡下觀察睪丸組織形態學變化。

1.3.5 免疫組織化學SP法檢測睪丸組織中p-CREB蛋白的表達 主要操作步驟如下：睪丸組織石蠟切片常規脫蠟水化，3%H2O2室溫封閉5～10min，置于0.01%枸櫞酸鹽緩沖液中微波抗原修復10min，5%～10%免疫血清封閉30min，加一抗(均為1∶100稀釋)置于37℃、1h后4℃過夜，HRP標記二抗(37℃、45min)，加SP(37℃、45min)，DAB顯色，上述各步之間均以0.01mol/LPBS洗3次，每次5min，最后胞核復染、脫水、透明、封片。用0.01mol/LPBS代替一抗作為陰性對照。

免疫組化結果判斷[7]：陽性表達的細胞被染成棕黃色，陰性表達的細胞不顯色。結果判定按染色細胞的數量比和染色深度進行半定量測定。顯微鏡下(400倍)對每例標本均隨機觀察5個曲細精管，結果根據染色程度及染色細胞百分率進行評定，不著色為0分，基本不著色為1分，著色淡為2分，著色深為3分。無著色細胞為0分，著色細胞占計數細胞＜1/3為1分，≥1/3～2/3為2分，≥2/3為3分。判定結果：兩者相加除以2，0分為陰性(-)，＜1為弱陽性(+)，≥1～2為中等陽性(++)，≥2～3分為強陽性(+++)。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 DEHP染毒對小鼠體質量的影響

DEHP染毒后，500、1000mg/kg劑量組各有1只小鼠于給藥后第6周出現會陰部污穢，于4～6d后恢復正常，其他小鼠未見明顯異常癥狀；給藥后第1周1000mg/kg劑量組小鼠體質量低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 DEHP染毒對小鼠睪丸、附睪臟器系數及精子計數的影響

隨著染毒劑量增加，睪丸和附睪質量下降，3個染毒組附睪系數和1000mg/kg組睪丸系數均顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。各染毒組精子計數均較對照組明顯減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 DEHP染毒對小鼠睪丸、附睪臟器系數及精子計數的影響(n=10，)

表1 DEHP染毒對小鼠睪丸、附睪臟器系數及精子計數的影響(n=10，)

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2.3 DEHP染毒小鼠睪丸組織形態學改變

對照組睪丸生精上皮排列整齊，形態結構完整，管腔中無脫落細胞，可見大量精子生成，支持細胞和間質細胞數量和結構均正常；250mg/kg組光鏡下發現局部生精上皮排列疏松、紊亂、層次減少。500、1000mg/kg組曲細精管上皮細胞排列疏松、紊亂、層次減少，管腔內有成團脫落的上皮細胞(見圖1)。

圖1 各組小鼠睪丸組織病理檢查結果(×200)

2.4 睪丸組織中p-CREB蛋白的表達

免疫組化染色結果顯示，小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白主要在圓形和長形精子細胞中表達，陽性產物主要位于胞核，精原細胞和精母細胞呈陰性表達，而在Sertoli細胞、管周細胞和間質細胞包括Leydig細胞中呈散在弱陽性表達(見圖2)。

圖2 DEHP染毒小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白的表達(×400)

隨著DEHP染毒劑量增加，小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白表達減弱，陽性細胞數減少，p-CREB蛋白表達評分降低，DEHP500和1000mg/kg組較對照組差異有統計學意義(P＜0.05，見表2)。

表2 DEHP對睪丸組織中p-CREB蛋白表達的影響

3 討論

DEHP是目前全球使用最為廣泛的鄰苯二甲酸酯類塑料增塑劑之一。釋放到環境中的DEHP可經消化道、呼吸道等途徑進入機體，其毒性作用主要表現在生殖毒性、胚胎發育毒性、免疫毒性、遺傳毒性、神經毒性等方面。研究表明，DEHP對雄性生殖系統的損害主要表現為睪丸毒性[8]。曲莉等[9]分別以250、500和1000mg/kgDEHP灌胃染毒成年雄性小鼠，每天1次，連續4周后發現，隨著DEHP劑量的升高，雄性小鼠睪丸與附睪質量及其臟器系數、精子計數呈下降趨勢，精子畸形率呈上升趨勢。在相同的DEHP暴露劑量下，幼齡動物的敏感性更強，本研究選擇初斷乳的雄性小鼠進行了8周的DEHP染毒，結果顯示，DEHP各染毒組附睪系數及精子計數均低于對照組，1000mg/kg組睪丸臟器系數低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；各染毒組小鼠睪丸生精上皮出現排列紊亂、層數減少、脫落等不同程度損傷。

細胞凋亡是發生在多細胞生物體中的一個調節過程。Sun等[10]研究發現DEHP可通過上調睪丸組織中Caspase-3、Caspase-8、Bax的蛋白水平，降低睪丸組織Bcl-2表達誘導睪丸組織凋亡。本研究各染毒組睪丸組織出現生精上皮細胞脫落可能與DEHP引起生精細胞凋亡有關。

cAMP/CREB信號通路參與精子的發生、運動、獲能等過程。cAMP與PKA的調節亞基結合導致催化亞基的釋放，并轉位至細胞核，使CREB在Ser133發生磷酸化。磷酸化的CREB結合到靶基因的特定序列cAMP反應元件，從而調節下游靶基因(睪丸組織所特有或參與精子發生的基因)的轉錄[6]，CREB的磷酸化是該通路的關鍵。Sheng等[11]研究發現CREB的磷酸化可導致小鼠精原細胞和人精原細胞瘤細胞大量增殖。有研究[12]報道CREB基因缺失、蛋白表達下調或蛋白磷酸化異常，均可導致生精細胞凋亡和壞死增加、精子生成減少，和減數分裂特有基因的表達下調。小鼠生精上皮發育根據形態學特征分為12個階段[13]，自生精上皮基底部至腔面，依次有精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子。本研究結果顯示DEHP染毒后小鼠睪丸p-CREB主要在精子細胞表達，提示該信號通路在減數分裂后精子發生過程中可能發揮重要作用。p-CREB蛋白表達水平與精子數量和精子存活率呈正相關[14]，本研究DEHP各染毒組小鼠精子數量減少，DEHP500和1000 mg/kg組小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白出現下調，提示DEHP染毒組小鼠生精數量減少可能與DEHP抑制CREB蛋白激酶磷酸化有關。

DEHP能導致腎臟損傷[15]，本研究DEHP500和1000mg/kg組小鼠出現會陰部污穢是否DEHP也可損傷泌尿系統或由其他部位引起還需進一步研究。DEHP致睪丸組織p-CREB表達下調的機制尚不明確，是否與DEHP引起cAMP含量減少[16]，或CREB磷酸化激酶如cAMP依賴蛋白激酶A、Ca2+/鈣調素依賴蛋白激酶Ⅳ等活性下降等有關[17]，尚需進一步研究。