RNR3啟動(dòng)子調(diào)控的紅綠熒光蛋白雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞對(duì)化學(xué)誘變?cè)暮Y選

姚 佳，劉 星，盧光玉，朱方渝，吳倩倩，李湘鳴，*

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225001；2.揚(yáng)州市衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 揚(yáng)州 225002；3.蘇州市相城人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215100)

核糖核苷酸還原酶是生物體內(nèi)唯一的催化4種核糖核苷酸還原、生成相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸的酶。該酶是DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵酶和限速酶，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起著調(diào)控作用。RNR3屬于核糖核酸還原酶(ribonucleotidereductase，RNR)中的一員，在正常生長(zhǎng)條件下，酵母細(xì)胞中的RNR3基因處于封閉狀態(tài)，當(dāng)誘變?cè)斐蒁NA損傷或合成阻斷時(shí)，可誘導(dǎo)該基因的大量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室曾將RNR3基因啟動(dòng)子與某報(bào)告基因(如yEGFP，LacZ等)相融合，構(gòu)建成重組酵母細(xì)胞，用于對(duì)化學(xué)誘變?cè)暮Y選[1]，但是在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度多數(shù)需用D(600)或蛋白含量進(jìn)行校正，在操作時(shí)，必須將細(xì)胞濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使D(600)位于0.2～0.5之間[2]，否則誤差較大，故操作不方便。

DsRed-Express-2是紅色熒光蛋白(DsRed)的突變體，具有成熟快的特點(diǎn)，最大吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為558和583nm，因此可用其作為“內(nèi)參比”，轉(zhuǎn)化于RNR3調(diào)控的yEGFP發(fā)光酵母細(xì)胞，用于校正因受試物的細(xì)胞毒性作用對(duì)yEGFP發(fā)光強(qiáng)度的影響。當(dāng)化學(xué)物誘變?cè)饔糜诮湍讣?xì)胞使其DNA損傷或合成阻斷時(shí)，會(huì)經(jīng)RNR3使yEGFP基因大量表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)yEGFP和DsRed-Express2熒光強(qiáng)度，其相對(duì)發(fā)光度(即yEGFP/DsRed-Express2比值)與化學(xué)誘變?cè)g存在著劑量-效應(yīng)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

所用化學(xué)誘變?cè)?gòu)自美國(guó)Sigma公司；倒置熒光顯微鏡(尼康Ti-U)由日本Nikon公司生產(chǎn)，多功能酶標(biāo)儀(Bio-TekSynergy2)由美國(guó)伯騰公司生產(chǎn)。

1.2 RNR3啟動(dòng)子調(diào)控的綠熒光蛋白雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞的建立

將RNR3啟動(dòng)子調(diào)控的yEGFP發(fā)光細(xì)胞(W303-1A/RNR3-yEGFP)[1]劃線接種于缺乏尿嘧啶(SD/-ura)的選擇性培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)3～4d，生長(zhǎng)出直徑為3～4mm的克隆。從SD/-ura培養(yǎng)板挑取W303-1A/RNR3-yEGFP的克隆，用醋酸鋰方法將pGPD-DsRed-Express2(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)[3]轉(zhuǎn)化于感受態(tài)酵母細(xì)胞W303-1A/RNR3-yEGFP，用SD/-trp,-ura選擇性培養(yǎng)板篩選陽(yáng)性克隆。挑取細(xì)胞克隆，分別制成細(xì)胞懸液，置于倒置熒光顯微鏡下，分別在藍(lán)色和綠色光激發(fā)下觀察細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度，選取可發(fā)出綠光和紅光的酵母克隆，命名為W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2。

1.3 RNR3調(diào)控的雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞對(duì)誘變?cè)暮Y選研究

挑取重組酵母細(xì)胞(W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2)克隆，接種于5mLSD/-trp,-ura培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取振蕩培養(yǎng)過(guò)夜酵母培養(yǎng)液2mL，加入SD/-trp,-ura10mL，混勻，取100 μL加入到96孔黑色酶標(biāo)板中，選取以下化學(xué)誘變?cè)M(jìn)行研究，每種化學(xué)誘變?cè)O(shè)12個(gè)濃度組，濃度梯度呈2倍稀釋。①與DNA發(fā)生結(jié)合的誘變?cè)啪€菌素(actinomycinD)和溴乙錠(ethidiumbromide)；②使DNA發(fā)生烷基化的誘變?cè)z裂霉素C(mitomycinC)、甲磺酸甲脂(methylmethanesulfonate，MMS)和瘤可寧(chlorambucil，苯丁酸氮芥)；③使DNA發(fā)生斷裂的誘變?cè)樸K(cis-Platinum)、4-硝基-N-氧化喹啉(4-nitroquinoline-N-oxide， 4-NQO)、 博 來(lái) 霉 素(bleomycin)和福來(lái)霉素(phleomycin)；④抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變?cè)?-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)、 羥 基 脲 (hydroxyurea)、 喜 樹(shù) 堿(camptothecin)和阿非迪霉素(aphidicolin)；⑤其他生物毒性作用的化合物，秋水仙堿(colchicine)、刀豆氨酸(canavanine)和四環(huán)素(tetracycline)。選用各自受試物的溶劑作為空白對(duì)照。溶液加入體積不超過(guò)總體積的2%。將96孔黑色酶標(biāo)板用保鮮膜密封，于30℃振蕩培養(yǎng)12h，用多功能酶標(biāo)儀(Bio-TekSynergy2)檢測(cè)綠色熒光蛋白(yEGFP)(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm，帶寬20nm)和紅色熒光蛋白(DsRed-Express-2)(激發(fā)波長(zhǎng)555nm，發(fā)射波長(zhǎng)585nm，帶寬20nm)的發(fā)光強(qiáng)度(luminousintensity，l)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

用Excel軟件計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度(relative fluorescence，RF)，即 yEGFP 與 DsRed-Express-2 之比。用RF表示酵母發(fā)光強(qiáng)度與受試物的劑量效應(yīng)關(guān)系，并求誘導(dǎo)倍數(shù)(foldincuction，F(xiàn)I)，即受試組與空白對(duì)照組的相對(duì)發(fā)光度之比。當(dāng)FI≥1.5倍以上，且受試物與RF具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系時(shí)，可判斷受試物為陽(yáng)性。

細(xì)胞毒性判斷：試驗(yàn)前首先測(cè)各空白對(duì)照組的DsRed-Express-2發(fā)光度(lDsRed-Express-2，對(duì)照組)，求 xˉ和s，以xˉ-1.64s作為判斷界值。當(dāng)受試物組的DsRed-Express-2發(fā)光度(lDsRed-Express-2，受試物)低于該界值時(shí)，則判斷受試物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性。本文經(jīng)研究確定l=500cd作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 yEGFP和DsRed-Express-2發(fā)光效果

圖1為W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2酵母細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下的觀察效果，可見(jiàn)分別在藍(lán)色和綠色光激發(fā)下，細(xì)胞發(fā)出綠光和紅光，說(shuō)明雙發(fā)光重組酵母細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖1 yEGFP和 DsRed-Express-2在RNR3啟動(dòng)子調(diào)控的酵母細(xì)胞中表達(dá)

2.2 雙發(fā)光重組酵母細(xì)胞對(duì)與DNA發(fā)生結(jié)合誘變?cè)暮Y選

與DNA發(fā)生結(jié)合的誘變?cè)?放線菌素D和EB)與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2的劑量效應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表1，可見(jiàn)在受試濃度范圍內(nèi)，隨著誘變?cè)瓭舛鹊纳撸珼sRed-Express-2發(fā)光度未見(jiàn)明顯下降，說(shuō)明未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，同時(shí)也未對(duì)yEGFP產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)作用，F(xiàn)I均在1.5以下。

表1 與DNA發(fā)生結(jié)合的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

表1 與DNA發(fā)生結(jié)合的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

放線菌素D濃度/(μg/L)0 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 200 400 lDsRed-Express-2 9589.0±403.4 8737.3±758.7 8710.3±633.0 8966.3±899.9 9340.0±1233.1 9221.3±926.9 8923.3±1080.4 8863.0±1601.1 9066.7±1130.2 8921.3±1700.9 9032.7±2152.1 9286.7±3478.0 FI 1.00±0.00 1.14±0.11 1.13±0.09 1.12±0.14 1.10±0.17 1.10±0.12 1.15±0.08 1.19±0.16 1.15±0.10 1.17±0.16 1.14±0.26 1.16±0.49 EB濃度/(μg/L)0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 lDsRed-Express-2 9066.0±182.4 8640.7±396.3 8335.7±532.1 8571.7±717.1 8651.7±839.1 8440.3±656.7 8779.3±1302.0 8401.3±619.4 8873.7±550.4 9603.3±496.9 10816.0±380.1 12595.7±15.3 FI 1.00±0.00 1.06±0.06 1.11±0.08 1.09±0.08 1.11±0.10 1.14±0.07 1.19±0.20 1.32±0.08 1.37±0.07 1.35±0.06 1.30±0.02 1.25±0.03

2.3 雙發(fā)光重組酵母細(xì)胞對(duì)使DNA發(fā)生烷基化誘變?cè)暮Y選

表2為與DNA發(fā)生烷基化的誘變?cè)?絲裂霉素C、MMS和瘤可寧)與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2的劑量效應(yīng)關(guān)系。可見(jiàn)絲裂霉素C在整個(gè)受試濃度范圍內(nèi)，未對(duì)yEGFP產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)作用，F(xiàn)I接近于1(在0.94-1.09的范圍內(nèi)波動(dòng))；而MMS和瘤可寧卻不同，對(duì)yEGFP產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)作用，MMS的FI明顯高于瘤可寧，前者為4.12，而后者為2.80。但是，瘤可寧在最高濃度組對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)毒性作用，表現(xiàn)為DsRed-Express-2發(fā)光度明顯降低，但仍大于500 cd。

表2 使DNA發(fā)生烷基化的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

表2 使DNA發(fā)生烷基化的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

絲裂霉素C濃度/(μg/L)0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 lDsRed-Express-2 8604.0±286.1 8368.3±553.5 8801.0±838.1 8427.3±1034.3 8591.7±787.1 8642.7±1119.0 8540.7±1013.6 8162.7±890.7 8599.3±833.1 8680.0±951.0 8726.0±877.4 8661.0±310.5 FI 1.00±0.00 1.06±0.04 1.03±0.07 1.07±0.10 1.07±0.08 1.12±0.11 1.09±0.10 1.08±0.10 1.04±0.08 1.02±0.07 0.98±0.06 0.94±0.06 MMS濃度/(μg/L)0 0.4 0.8 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50 100 200 400 lDsRed-Express-2 9283.0±103.6 8709.0±667.9 8920.0±794.2 8596.0±173.9 9290.0±875.5 8917.3±846.2 8770.3±511.5 9040.3±476.7 7967.3±1617.8 8679.7±841.1 9447.0±559.1 8295.0±2658.2 FI 1.00±0.00 1.10±0.05 1.07±0.07 1.16±0.13 1.03±0.09 1.09±0.13 1.11±0.07 1.35±0.26 1.40±0.29 1.30±0.14 3.68±0.22 4.12±0.92瘤可寧濃度/(μg/L)0 0.20 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 9916.7±256.7 9366.0±206.2 9544.0±569.2 9503.3±796.4 9965.3±1218.1 10054.7±1611.1 10092.7±487.5 9668.3±946.0 8157.0±3107.7 7475.0±3505.7 6243.3±2466.0 2920.7±981.8 FI 1.00±0.00 1.05±0.01 1.02±0.06 1.04±0.06 0.98±0.14 0.98±0.20 0.94±0.06 0.98±0.09 1.29±0.58 1.49±0.91 1.62±0.71 2.80±1.12

2.4 雙發(fā)光重組酵母細(xì)胞對(duì)使DNA發(fā)生斷裂誘變?cè)暮Y選

表3為使DNA發(fā)生斷裂的誘變?cè)?-NQO、順鉑、博來(lái)霉素和福來(lái)霉素與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2劑量效應(yīng)關(guān)系。可見(jiàn)4-NQO與重組酵母有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，在0.08μg/mL以上時(shí)，F(xiàn)I開(kāi)始升高，最高達(dá)4.69；雖然在5μg/mL以上組時(shí)，F(xiàn)I升高非常明顯，但是，DsRed-Express-2卻明顯下降，平均發(fā)光度低于空白水平，因此，這種FI的升高變化，并非是4-NQO的誘導(dǎo)作用，而是兩種熒光蛋白本底“噪聲”的變化所致。在不同濃度的順鉑、博來(lái)霉素和福來(lái)霉素作用下，未發(fā)現(xiàn)雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞與其有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，也未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性，但是，福來(lái)霉素的DsRed-Express-2發(fā)光度普遍偏低，可能是該受試物溶劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

表3 使DNA發(fā)生斷裂的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

表3 使DNA發(fā)生斷裂的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

4-NQO濃度/(μg/L)0 0.02 0.04 0.08 0.16 0.32 0.62 1.26 2.5 5 10 20 lDsRed-Express-2 3936.0±234.3 3914.3±139.0 3934.3±52.3 3729.3±65.5 3006.7±172.0 2331.3±112.2 1476.0±46.9 874.3±73.4 567.0±31.0 447.7±12.9 479.3±2.1 410.3±30.8 FI 1.00±0.00 0.99±0.11 0.97±0.08 1.01±0.07 1.21±0.14 1.51±0.03 2.15±0.10 3.18±0.41 4.69±0.51 5.74±0.59 5.32±0.41 6.47±0.89濃度/(μg/L)0 0.2 0.5 1.0 2.0 4 8 1 6 31 62.5 125 250順鉑lDsRed-Express-2 19088.3±391.7 18412.0±1117.2 18091.0±1021.8 18786.0±1661.7 18878.3±1492.7 19248.0±2740.2 18925.0±2568.0 19975.±2341.3 19682.3±1778.3 20086.7±1227.0 20684.0±992.0 20008.0±993.4 FI 1.00±0.00 1.03±0.04 1.04±0.03 1.01±0.08 1.01±0.08 1.01±0.13 1.06±0.12 1.01±0.12 1.02±0.09 1.03±0.07 1.01±0.08 1.10±0.10博來(lái)霉素濃度/(μg/L)0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 lDsRed-Express-2 10926.0±753.7 9647.0±1006.3 9500.0±893.5 9379.0±968.6 9196.7±1047.9 9609.0±1508.3 9676.7±1307.5 9532.7±911.4 9399.0±809.5 9415.7±801.7 8858.7±527.5 8505.7±211.2 FI 1.00±0.00 1.13±0.04 1.12±0.06 1.14±0.05 1.13±0.02 1.13±0.11 1.10±0.08 1.15±0.07 1.20±0.06 1.22±0.05 1.31±0.01 1.32±0.07福來(lái)霉素濃度/(μg/L)0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 716.0±24.6 738.7±17.2 733.7±13.6 731.0±6.6 735.0±13.0 709.0±9.5 717.7±14.5 744.7±14.2 748.7±9.3 747.7±14.4 744.3±30.7 706.0±10.8 FI 1.00±0.00 1.01±0.11 1.00±0.11 0.99±0.14 1.16±0.22 1.03±0.16 1.01±0.17 0.99±0.16 1.00±0.17 0.98±0.17 0.97±0.18 1.01±0.03

2.5 雙發(fā)光重組酵母細(xì)胞對(duì)抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶誘變?cè)暮Y選

表4為抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變?cè)?5-FU、喜樹(shù)堿、阿非迪霉素和羥基脲)與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2的劑量效應(yīng)關(guān)系。由表可見(jiàn)，不同濃度的5-FU作用于雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞后，0.5μg/mL以上組的FI均達(dá)2.00以上，但升高速度緩慢，最高為4.08，也未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。喜樹(shù)堿、阿非迪霉素和羥基脲作用下，在受試濃度范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與重組酵母細(xì)胞有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，各濃度組FI均在1.5以下，DsRed-Express-2發(fā)光度變化比較穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)差變化不大，均小于1/2均數(shù)，說(shuō)明未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。

表4 抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

表4 抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變?cè)瓕?duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

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2.6 雙發(fā)光重組酵母細(xì)胞對(duì)其他生物化學(xué)毒性作用化合物的篩選

表5為重組雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞在非基因毒性化合物(秋水仙素、四環(huán)素和刀豆氨酸)的作用下，在受試濃度范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與FI有劑量效應(yīng)關(guān)系，也未發(fā)現(xiàn)對(duì)DsRed-Express-2發(fā)光度產(chǎn)生明顯的影響。雖然四環(huán)素在最高濃度組(200μg/mL)FI大于1.5，為1.89，但是，其他各濃度組FI均低于1.5，并呈隨機(jī)波動(dòng)。這可能是在高濃度情況下，四環(huán)素中的某些佐劑所產(chǎn)生的熒光所致。

表5 其他生物化學(xué)毒性作用的化合物對(duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

表5 其他生物化學(xué)毒性作用的化合物對(duì)W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發(fā)光度的影響

秋水仙素濃度/(μg/L)0 0.5 1 2 4 8 1 6 31 62.5 125 250 500 lDsRed-Express-2 16764.3±338.3 16176.3±228.2 15779.3±527.2 16348.3±149.8 16515.7±85.0 16479.0±856.6 16953.7±701.1 17412.7±1258.7 17491.3±1076.9 17528.0±854.5 17977.0±1225.1 21315.7±394.8 FI 1.00±0.00 1.05±0.06 1.13±0.13 1.01±0.06 0.99±0.05 1.01±0.05 0.98±0.08 0.94±0.06 0.94±0.07 0.93±0.02 0.92±0.07 0.76±0.04四環(huán)素濃度/(μg/L)0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 20163.0±1457.7 18210.3±1028.0 17672.0±723.7 17382.3±830.4 17667.0±664.4 16841.3±966.9 17436.0±537.6 16802.0±112.3 16948.0±321.1 16512.3±396.7 16727.7±577.9 16390.7±798.7 FI 1.00±0.00 1.10±0.08 1.15±0.11 1.16±0.09 1.13±0.07 1.25±0.08 1.18±0.09 1.30±0.17 1.25±0.12 1.37±0.18 1.46±0.19 1.89±0.28刀豆氨酸濃度/(μg/L)0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 18603.7±1124.3 17639.0±622.5 18216.3±1335.1 19058.7±2062.7 19281.0±2048.2 19979.0±2300.1 19806.0±1402.7 19536.0±1345.3 19980.3±1037.0 20597.0±903.5 21000.7±1078.2 20775.3±5317.8 FI 1.00±0.00 1.03±0.06 1.02±0.08 0.95±0.05 0.95±0.06 0.91±0.05 0.91±0.01 0.93±0.02 0.92±0.04 0.89±0.04 0.91±0.02 1.01±0.35

3 討論

目前現(xiàn)行的化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性體外測(cè)試方法有Ames實(shí)驗(yàn)、SOS和SOS/umu顯色反應(yīng)、Comet分析法、程序外DNA合成實(shí)驗(yàn)、V79/HGPRT基因突變分析法和哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等一系列[4-9]，可概括為原核細(xì)胞和真核高等生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩大類。在原核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Ames、SOS和SOS/umu應(yīng)用較多，特別是Ames實(shí)驗(yàn)得到非常廣泛地應(yīng)用，也是我國(guó)化學(xué)物安全評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)首選項(xiàng)目。但是，原核細(xì)胞除了所需菌種較多、假陽(yáng)性高、操作十分繁瑣外，主要原因是其基因結(jié)構(gòu)、基因調(diào)控和代謝與真核細(xì)胞有相當(dāng)大的不同，因此，原核細(xì)胞用于化學(xué)物質(zhì)的致突變性篩選時(shí)，具有一定的局限性。高等生物細(xì)胞雖無(wú)基因結(jié)構(gòu)、調(diào)控和代謝方面的局限性，但是，其培養(yǎng)條件復(fù)雜，對(duì)化學(xué)物的毒性抵抗力差，故選用高等生物細(xì)胞也無(wú)法對(duì)化學(xué)物的遺傳毒性進(jìn)行快速、自動(dòng)化、高通量的體外篩選。

酵母是單細(xì)胞低等真核生物細(xì)胞，不僅具有易培養(yǎng)、繁殖、生長(zhǎng)條件要求不高、對(duì)環(huán)境有害化學(xué)物抵抗力較強(qiáng)等特點(diǎn)外，而且具有遺傳背景清楚、基因結(jié)構(gòu)、基因調(diào)控、代謝和蛋白質(zhì)翻譯后加工與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相似等特點(diǎn)[10-12]。所以，將DNA重組技術(shù)、基因表達(dá)技術(shù)和酵母細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)相結(jié)合，構(gòu)建成重組酵母細(xì)胞，用于快速、高通量篩選化學(xué)誘變?cè)抢硐氲倪x擇，也具有良好的發(fā)展應(yīng)用前景。化學(xué)誘變物作用酵母細(xì)胞造成DNA損傷或是合成阻斷時(shí)，通過(guò)各種基因調(diào)控作用，可誘導(dǎo)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在所誘導(dǎo)的特殊基因的轉(zhuǎn)錄中，最受關(guān)注的是RNR3、RNR2、RAD54和MAG1[13-18]。正常生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到RNR3、RNR2、RAD54和MAG1的表達(dá)。RNR3屬于核糖核酸還原酶(ribonucleotide reductase，RNR)系統(tǒng)的一員，其中RNR1和RNR3編碼該酶的大亞基，RNR2和RNR4編碼小亞基[19-20]，DNA斷裂損傷時(shí)及合成阻斷時(shí)可誘導(dǎo)RNR3等相關(guān)基因的表達(dá)[21-23]。

因此，國(guó)外有研究者將RNR3等相關(guān)基因啟動(dòng)子與蟲(chóng)熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)基因相串聯(lián)，轉(zhuǎn)染于酵母細(xì)胞，構(gòu)建成重組酵母細(xì)胞，用于化學(xué)誘變?cè)暮Y選[24-25]。當(dāng)化學(xué)誘變物作用于酵母細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因會(huì)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與誘變?cè)g存在著劑量-效應(yīng)關(guān)系。但是，用蟲(chóng)熒光酶作為報(bào)告基因雖然較敏感，但不適合我國(guó)國(guó)情，原因是：①成本較高。它必須采用蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶兩個(gè)報(bào)告基因，這是因?yàn)檎T變?cè)嚓P(guān)基因啟動(dòng)子調(diào)控的蟲(chóng)熒光酶發(fā)光度，不僅與受試物的誘導(dǎo)有關(guān)外，還與細(xì)胞的數(shù)量和活性狀態(tài)有關(guān)，因此必須用海腎螢光素酶發(fā)光度校正其影響。兩者酶的底物較昂貴；②操作繁瑣。蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其底物無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，必須對(duì)細(xì)胞壁加以裂解，因而操作繁瑣，難以達(dá)到自動(dòng)化、高通量。而采用綠色熒光蛋白(yEGFP)基因可克服蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的某些缺點(diǎn)。

當(dāng)化學(xué)誘變?cè)饔糜谥亟M酵母細(xì)胞時(shí)，對(duì)DNA的損害必然會(huì)發(fā)生累加效應(yīng)，因此，yEGFP的發(fā)光程度，除了與化學(xué)誘變?cè)淖饔脧?qiáng)度有關(guān)外，還與作用時(shí)間有關(guān)。但是，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，化學(xué)誘變?cè)慕到庖矔?huì)加速。結(jié)合不同化學(xué)誘變?cè)睦砘瘜傩裕覀冄芯堪l(fā)現(xiàn)平均作用時(shí)間為12h效果較理想。當(dāng)誘變?cè)饔糜诮湍讣?xì)胞時(shí)，同時(shí)會(huì)使細(xì)胞數(shù)量和活性狀態(tài)發(fā)生變化，所以，yEGFP的發(fā)光度需進(jìn)行校正。雖然綠色熒光蛋白(GFP)基因可克服蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的某些缺點(diǎn)，但國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用D(600)值來(lái)校正發(fā)光度以校正細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)對(duì)yEGFP發(fā)光度的影響。由于D(600)只能說(shuō)明活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)總數(shù)量，無(wú)法恒量細(xì)胞的狀態(tài)，故誤差較大[26]。

紅色熒光蛋白(DsRed)是從珊瑚蟲(chóng)Discosomagenus中克隆的一種在紫外光的照射下可發(fā)射紅色熒光的蛋白，有許多突變體。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)DsRed-Express-2能在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)，將其重組于酵母細(xì)胞作為內(nèi)參比(為第二信號(hào))，用以反映細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)，通過(guò)分別測(cè)yEGFP和DsRed-Express-2發(fā)光強(qiáng)度，用yEGFP/DsRed-Express-2的比值即相對(duì)發(fā)光度消除細(xì)胞數(shù)量及狀態(tài)不同對(duì)yEGFP發(fā)光度的影響。該雙發(fā)光酵母細(xì)胞不需要添加任何化學(xué)反應(yīng)試劑，可在96或384孔細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)操作，故能方便、快速、定性、定量、高通量、自動(dòng)化地篩選化學(xué)誘變物。

在所受試的化學(xué)誘變?cè)校行┛赡苁且蚍肿恿枯^大(如絲裂霉素C等)，不易進(jìn)入細(xì)胞；有些可能是在細(xì)胞酶的作用下被滅活。這可能是呈現(xiàn)陰性結(jié)果的原因。

四環(huán)素是從放線菌金色鏈叢菌(Streptomyces aureofa-ciens)的培養(yǎng)液等分離出來(lái)的抗菌物質(zhì)，是一種廣譜抗菌素，其作用機(jī)制是與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，從而阻止氨酰基-tRNA同核糖核蛋白體結(jié)合；刀豆氨酸的結(jié)構(gòu)與精氨酸相似，可代替精氨酸合成蛋白質(zhì)，由于刀豆氨酸與精氨酸結(jié)構(gòu)的不同，所形成蛋白質(zhì)的功能也會(huì)出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡；秋水仙素是一種生物堿，能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。以上這3種化學(xué)物均呈陰性結(jié)果，說(shuō)明該細(xì)胞具有良好的特異性。

當(dāng)化學(xué)誘變?cè)饔脵C(jī)體細(xì)胞時(shí)，會(huì)通過(guò)各種DNA作用水平引起基因突變。化學(xué)物是否會(huì)引起機(jī)體細(xì)胞基因發(fā)生突變，與化學(xué)物性質(zhì)、作用細(xì)胞DNA的途徑以及細(xì)胞的生物屬性等因素有關(guān)。因此，現(xiàn)行的化學(xué)物致突變?cè)u(píng)價(jià)方法，是通過(guò)各種不同方法或途徑篩選化學(xué)誘變?cè)淠康氖菧p低化學(xué)物對(duì)人體發(fā)生基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。與構(gòu)建的RNR2調(diào)控的雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞相比較[3]，雖然，RNR3調(diào)控的雙信號(hào)發(fā)光酵母細(xì)胞假陰性率較高，但提供了一種新的篩選誘變?cè)姆椒ɑ蚵窂剑绻鳛閭鹘y(tǒng)化學(xué)物致突變?cè)u(píng)價(jià)方法的補(bǔ)充，這無(wú)疑會(huì)進(jìn)一步降低所評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)人體基因致突變的風(fēng)險(xiǎn)。