2-乙酰基-4-羥基-丁基咪唑對小鼠細胞免疫功能的影響

段驍驍，肖倩倩，魏雪濤，郝衛東*

(北京大學公共衛生學院毒理學系/食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191)

焦糖色，又名焦糖、焦糖色素，是糖類物質在高溫下脫水、分解、聚合而成的紅褐色或黑褐色混合型化合物，是我國允許在食品中使用的最重要天然色素之一，其產銷量占到天然色素的80%以上[1-2]，廣泛用于醬油、醋、啤酒、調味料等食品中。焦糖色按照使用添加劑的不同可分為普通法生產的I類焦糖色，加亞硫酸鹽生產的II類焦糖色，加氨生產的III類焦糖色和亞硫酸氨法生產的IV類焦糖色，其中IV類焦糖色使用率最高，其次為III類。2-乙酰基-4-羥基-丁基咪 唑 (2-Acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole， THI)是III類焦糖色生產、加工過程中的主要副產物，因其在動物實驗中表現出免疫毒性而受到廣泛關注。研究表明，大鼠攝入III類焦糖色后約1/3的有色物質被吸收[3]，其經口半數致死劑量(LD50)高于17500mg/kg[4]，長期攝入可導致大鼠外周血中淋巴細胞數顯著減少，同時抑制大鼠特異性和非特異性免疫功能[5-8]。Sinkeidam等[5]發現III類焦糖色對大鼠免疫系統的影響是由THI導致的，Gobin等[8]進一步證實，單獨攝入THI可影響多項大鼠免疫功能指標，如胸腺淋巴細胞數顯著增加，T細胞增殖能力降低和NK細胞活性下降等。Gugasyan等[9]發現單獨攝入THI可以抑制小鼠的接觸性超敏反應，并引起外周血中淋巴細胞的減少，而補充維生素B6可在不同程度上緩解THI引起的淋巴細胞減少癥[10-11]，目前尚無THI遺傳毒性和致癌性的報道[12]。因THI可導致嚙齒類動物出現可逆性的淋巴細胞減少癥，FAO/WHO食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)將III類焦糖色的每日允許攝入量(acceptable dailyintake，ADI)定為200mg/kg，THI限量25mg/kg。因Maekawa等[13]提出THI在大鼠體內的無可見有害作用水平(noobservedadverseeffectlevel，NOAEL)為20g/kg，歐洲食品安全局(EFSA)據此將III類焦糖色的ADI下調為100mg/kg，THI限量10mg/kg。

鑒于焦糖色在我國食品生產加工過程中應用廣泛，公眾對焦糖色及其副產物健康風險的關注度不斷增加，因此國家衛生和計劃生育委員會在2017年對中國居民膳食焦糖色暴露風險進行了專項評估，在該過程中發現，THI相關的毒理學資料十分陳舊，研究內容有限且研究結果不一，不能針對敏感的毒性效應終點獲得可靠的毒理學數據，難以滿足對其開展健康風險評估的需求。為彌補相關毒理學資料的空缺，同時為開展THI健康風險評估提供毒理學數據，本實驗研究了7d和30d連續暴露THI對小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c雌鼠，購自北京大學醫學部實驗動物科學部。6～8周齡，體質量18～22g，飼養于屏障環境，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，12h/12h明暗交替循環，飼料為符合國家標準的普通維持飼料，無菌墊料，飲用水經過濾除菌處理，動物自由飲水和攝食。動物實驗符合北京大學動物福利和管理委員會的相關規定。

1.2 主要試劑與儀器

2-乙酰基-4-羥基-丁基咪唑(THI)、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養液購自美國Hyclone公司；流式抗體 anti-mouseCD3FITC、anti-mouseCD4PE/CyTM5、anti-mouseCD8PE/Cyanine7購自北京達科為生物技術有限公司。

全自動血球計數儀購于日本NIHONKOHDEN公司；流式細胞儀購于美國Beckman公司；多功能酶標儀購于德國Omega公司；低溫高速離心機購于德國Heraeus公司。

1.3 分組與處理

將小鼠按體質量隨機分為對照組(超純水組)和THI低、中、高劑量組，每組12只。按染毒周期分為7d和30d實驗組，連續每天灌胃給藥，灌胃量均按20 μL/g。7d染毒劑量為0、0.5、2.5、12.5mg/kg，30d為0、0.2、0.5、2.5mg/kg。小鼠麻醉后摘除眼球取血，頸椎脫臼處死動物，進行相關指標檢測。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 外周血白細胞分類計數 眼球取血于抗凝管內，全自動血球計數儀計數白細胞總數；制備血涂片，瑞氏染液進行染色，鏡下計數200個白細胞。

1.4.2 胸腺T細胞分類計數 分離胸腺于PBS，研磨至單細胞懸液；細胞計數后轉移至5mL流式管中(每管1×106個細胞)，PBS洗滌一次(4 ℃、350g/min，離心5min)；棄上清，用100μL流式染色液重懸細胞沉淀，加入細胞表面分子抗體CD3、CD4和CD8混合液，混勻后4℃避光孵育30min；孵育結束，加入2 mL流式染色液洗滌一次(4℃、350g/min離心5 min)；棄上清，樣品用300μL流式染色液重懸，立即采用流式細胞儀進行T細胞分類檢測。

1.4.3 T淋巴細胞增殖功能測定 無菌條件下分離脾臟于 Hanks液，研磨至單細胞懸液；轉移至15mL離心管，Hanks液洗滌一次(350g/min，5min)；棄上清，重懸于2mLRPMI-1640完全培養液中，臺盼藍染色計數活細胞數(活細胞應在95%以上)，并調整細胞濃度至2×106/mL；每份細胞懸液分2孔加入24孔板中(1mL/孔)，其中一孔加入50μLConA液(終濃度為5μg/mL)，另一孔作為對照，培養72h；培養結束前4h，每孔棄去培養液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI-1640培養液，同時加入MTT(5mg/mL，50μL/孔)；培養結束后每孔加入1mL酸性異丙醇，混勻后分裝到96孔板中，每孔分裝3個平行樣，用多功能酶標儀檢測，結果以波長570nm處的光密度值表示。

1.4.4 NK細胞活性實驗 實驗前72h將YAC-1細胞(靶細胞)傳代培養，實驗中用RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度至1×105/mL；無菌條件下分離小鼠脾臟于Hanks液，研磨至單細胞懸液；轉移至15mL離心管，Hanks液洗滌一次(350g/min，5min)；棄上清，重懸于2mLRPMI-1640完全培養液中，臺盼藍染色計數活細胞數(活細胞應在95%以上)，并調整細胞濃度至5×106/mL；取靶細胞和效應細胞各100μL加入U型96孔板中，同時設靶細胞自然釋放孔(靶細胞和培養液各100μL)、靶細胞最大釋放孔(靶細胞和5%TritonX-100各100μL)，培養4h；培養結束后，1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置于平底96孔板，加入LDH基質液100μL，反應3min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，測定D(490)值，按下式計算NK細胞活性：

1.4.5 T細胞趨化功能檢測 無菌條件分離脾臟于PBS中，研磨至單細胞懸液，PBS洗滌一次(4℃，350g/min，離心5min)；棄上清，重懸于RPMI-1640完全培養液中，調整細胞濃度為8×106/mL，加至96孔Transwell趨化小室上室(25μL/孔)，將含不同濃度1-磷酸鞘氨醇(S1P)的相同培養基用于下室(29μL/孔)；培養1h后，收集下室內容物于EP管內，350g/min離心5min；將細胞沉淀重懸于流式染色液中，進行抗體染色，具體過程同1.4.2。

1.5 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，多組均數間比較采用單因素方差分析，方差不齊時采用Dunnett'sT3檢驗，兩組均數之間比較采用t檢驗，方差不齊時采用t檢驗，數據表達方式為。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 THI對小鼠體質量和臟器質量的影響

THI對BALB/c小鼠體質量和臟器質量的影響如圖1所示。7d和30dTHI連續染毒結束時，染毒組小鼠體質量、肝、胸腺、雙側腹股溝淋巴結和淺表淋巴結(頜下、腋下和腹股溝淋巴結)質量與對照組相比均未出現明顯變化(P＞0.05)，僅連續染毒30d時高劑量組(2.5mg/kg)小鼠脾臟質量明顯下降(P＜0.05)。

圖1 THI對小鼠體質量和臟器質量的影響(n=12)

2.2 THI對外周血白細胞數的影響

THI染毒7d對小鼠外周血白細胞數的影響如圖2所示。與對照組相比，THI2.5和12.5mg/kg劑量組白細胞總數均明顯降低(P＜0.05)；12.5mg/kg劑量組淋巴細胞數明顯降低(P＜0.05)；2.5和12.5mg/kg劑量組淋巴細胞占白細胞總數比值下降(P＜0.05)。

圖2 THI染毒7d對小鼠外周血白細胞數的影響(n=12)

THI30d染毒小鼠外周血白細胞數變化情況如圖3所示。與對照組相比，THI0.5和2.5mg/kg組白細胞總數明顯降低(P＜0.05)，2.5mg/kg組淋巴細胞數顯著下降(P＜0.05)，淋巴細胞占白細胞數比值、單核細胞數、中性粒細胞數在各劑量組中未觀察到明顯變化(P＞0.05)。THI染毒7d和30d各組的紅細胞數均在正常值范圍內。

圖3 THI染毒30d對小鼠外周血白細胞數影響(n=12)

2.3 THI對胸腺T細胞數的影響

THI染毒7d小鼠胸腺細胞數的變化結果如圖4所示。與對照組相比，12.5mg/kg劑量組胸腺細胞總數和T細胞數顯著升高(P＜0.05)，0.5和2.5mg/kg劑量組變化不大，T細胞占胸腺細胞總數比例在各組中基本保持一致。T細胞數升高主要是由于單陽性T細胞(CD4+和CD8+T細胞)數增加所致，2.5和12.5mg/kg劑量組單陽性T細胞數顯著升高(P＜0.05)，雙陽性T細胞(CD4+CD8+T細胞)和雙陰性T細胞(CD4+CD8+T細胞)數在各組間差異不明顯，具體見表1。

圖4 THI染毒7d對小鼠胸腺細胞數的影響(n=12)

表1 THI染毒7d對T淋巴細胞不同亞群細胞數的影響(×109/L，n=12)

如圖5所示，THI染毒30d，與對照組相比，2.5 mg/kg組胸腺細胞數和T細胞數顯著性升高(P＜0.05)。2.5mg/kg組CD4+T細胞和CD8+T細胞明顯升高(P＜0.05)，0.5mg/kg劑量組CD4+T細胞數明顯升高(P＜0.05)，但CD8+T細胞數未觀察到明顯變化。見表2。

圖5 THI染毒30d對小鼠胸腺細胞數的影響(n=12)

表2 THI染毒30d對T淋巴細胞不同亞群細胞數的影響(×109/L，n=12)

2.4 THI對T細胞增殖功能的影響

如圖6所示，與對照組相比，THI染毒7d僅在12.5mg/kg劑量組表現出對T細胞增殖功能的抑制，THI染毒30d，0.5和2.5mg/kg劑量組T細胞增殖功能均明顯降低(P＜0.05)。

圖6 THI對小鼠T細胞增殖功能的影響(n=12)

2.5 THI對NK細胞活性的影響

如圖7所示，與對照組相比，THI染毒7d和30d后，均在2.5mg/kg劑量組觀察到NK細胞活性明顯降低(P＜0.05)；0.5mg/kg劑量組僅在30d染毒中表現出對NK細胞活性的影響(P＜0.05)。

圖7 THI對小鼠NK細胞活性的影響(n=12)

2.6 THI對T細胞趨化功能的影響

如圖8所示，THI染毒7d，與對照組相比，在1 nmol/L的S1P處理組，CD4+T和CD8+T細胞均在12.5 mg/kg時出現對S1P趨化功能的明顯降低(P＜0.05)，CD8+T細胞在2.5mg/kg劑量組也出現該功能的降低(P＜0.05)。10nmol/L的S1P對CD4+和CD8+T細胞的趨化誘導作用最為明顯，兩種細胞在2.5和12.5mg/kg劑量組均出現趨化功能的明顯降低(P＜0.05)；0.5mg/kg劑量組CD8+T細胞也表現出趨化功能的下降(P＜0.05)。在100nmol/L濃度的S1P處理組，CD4+T細胞2.5和12.5mg/kg劑量組趨化功能受到抑制(P＜0.05)，而CD8+T細胞僅在12.5mg/kg劑量組出現趨化功能抑制(P＜0.05)。

圖8 THI染毒7d對T細胞趨化功能的影響(n=6)

如圖9所示，在30d染毒實驗中，與對照組相比，1和10nmol/L濃度S1P處理組，0.5和2.5mg/kg劑量組CD4+T細胞和CD8+T細胞的趨化功能均明顯降低(P＜0.05)；100nmol/LS1P濃度處理組，0.5和2.5 mg/kg劑量組CD4+T細胞趨化功能明顯受到抑制(P＜0.05)，但CD8+T細胞僅在2.5mg/kg劑量組表現出趨化功能的降低(P＜0.05)，0.5mg/kg劑量組未觀察到該功能的明顯改變。

圖9 THI染毒30d對T細胞趨化功能的影響(n=6)

3 討論

THI作為III類焦糖色生產加工過程中的主要副產物之一，因其在動物體內具有免疫毒性而得到廣泛關注，但有關THI的毒理學研究，年代久遠，資料陳舊，數據缺失嚴重，結果缺乏統一標準，且受限于實驗方法和技術，評價內容和手段有限，不能針對敏感的毒性效應終點得到可靠的毒理學數據；研究對象較為單一，多數亞急性毒性實驗和亞慢性毒性實驗的研究對象均為大鼠，以小鼠為受試動物開展的相關研究較少。鑒于我國對于開展THI健康風險評估的迫切需要，本實驗選用BALB/c雌鼠作為研究對象，運用多種敏感的免疫功能評價方法，從多個方面全面地、系統地評價了THI的對小鼠免疫功能的影響，包括非特異性免疫功能和特異性免疫功能，初步得到小鼠THI連續染毒30d的NOAEL水平為0.2mg/kg，對于開展THI風險評估具有重要的參考價值。

因多數研究指出，THI的免疫毒作用在嚙齒類動物中不會表現出性別差異[13-15]，故本實驗選用單一性別小鼠作為研究對象。7d染毒實驗劑量設置時，綜合考慮III類焦糖色和THI在人群中的實際可能暴露水平[我國III類焦糖色平均攝入量約為33.71mg/(kg·d)，其中THI平均攝入量約為24.12mg/(kg·d)]、JECFA和EFSA對于III類焦糖色中THI的限量規定以及對歷史文獻相關毒理學數據進行換算等多個方面，最終確定劑量梯度為0、0.5、2.5和12.5mg/kg。THI7d染毒的研究結果顯示，THI表現出劑量反應關系和免疫抑制作用，2.5mg/kg劑量組在多項檢測指標上已出現明顯改變，同時0.5mg/kg劑量組在部分指標上已出現劑量相關的輕微變化，雖然差異不具有統計學意義。考慮到THI30d連續染毒實驗更長的暴露周期，并以獲得小鼠30d暴露的NOAEL水平為研究目的，故將30d染毒實驗的劑量調整為0、0.2、0.5和2.5mg/kg。

研究結果顯示，THI連續暴露7d和30d均不會改變小鼠體質量、攝食量和飲水量，也不會影響小鼠胸腺、肝、淺表淋巴結的質量和臟器系數。因7d染毒實驗中未發現THI對雙側腹股溝淋巴結質量的影響，故在30d染毒實驗中摘取了小鼠雙側腹股溝淋巴結、頜下淋巴結和腋下淋巴結，但均未在實驗中觀察到THI對這3類淺表淋巴結質量的影響。但值得注意的是，THI30d染毒在2.5mg/kg劑量組觀察到脾臟質量的明顯降低，而7d染毒2.5mg/kg劑量組及更高的12.5mg/kg劑量組均為未觀察到脾臟質量的明顯變化。

研究結果顯示，THI在小鼠體內可引起血中白細胞數顯著減少和胸腺細胞數顯著增加。7d和30d染毒中，紅細胞數、中性粒細胞數、單核細胞數等均未觀察到明顯變化，淋巴細胞變化情況與白細胞一致，且所占比例在各組基本保持不變，可認為外周血中白細胞數的減少是由于淋巴細胞數減少所引起的，而胸腺細胞總數的升高是由于T細胞數明顯增加導致的。兩次實驗中胸腺細胞總數變化情況與T細胞變化情況均保持一致，且T細胞占胸腺細胞總數比值在各組間基本保持一致。同時還觀察到THI可對胸腺T細胞亞群細胞數產生明顯影響。THI染毒7d，2.5和12.5 mg/kg劑量組的單陽性T細胞(CD4+和CD8+)數均顯著性升高，雙陽性(CD4+CD8+)和雙陰性(CD4-D8-)T細胞數基本保持不變，而THI30d染毒2.5mg/kg劑量組單陽性T細胞數也出現明顯升高，0.5mg/kg劑量組僅出現CD4+T細胞數的升高，CD8+T細胞數未觀察到明顯變化。以上實驗結果提示THI可能影響T細胞陽性選擇過程或影響T細胞凋亡，但已有研究指出THI不會改變胸腺中T細胞凋亡比率[16]，故THI是否作用于T細胞分化成熟過程有待進一步的研究。

在THI對免疫功能影響方面，7d染毒僅在12.5 mg/kg劑量組出現T細胞增殖功能的明顯降低，而30 d染毒的0.5和2.5mg/kg劑量組均出現T細胞增殖功能受損，兩次實驗脾中T細胞數各劑量組與對照組相比未出現明顯差異，說明THI可以抑制單個T細胞的增殖功能。THI染毒7d的2.5和12.5mg/kg劑量組出現NK細胞活性的降低，0.5mg/kg劑量組未觀察到該現象，而30d染毒的0.5和2.5mg/kg均表現出NK細胞活性的明顯降低。趨化性功能研究中，連續染毒7d和30d，CD4+和CD8+T細胞均對10nmol/L濃度的S1P處理表現出最強的趨化能力，同時該條件在THI作用下，兩種細胞趨化功能受損程度最大。7d染毒2.5和12.5mg/kg劑量組CD4+T細胞在10和100nmol/L S1P濃度處出現趨化功能降低，僅12.5mg/kg劑量組在1nmol/L濃度處理下細胞出現功能受損，而2.5和12.5mg/kg劑量組的CD8+T細胞在1和10nmol/LS1P濃度處理條件下均出現趨化功能降低，100nmol/L濃度處理組該細胞功能的降低僅在12.5mg/kg劑量組出現，說明CD8+T細胞對低濃度S1P的趨化功能在THI連續染毒7d條件下更易受到影響，而CD4+T細胞對較高濃度S1P的趨化功能改變更易在THI連續染毒7d條件下出現。30d染毒實驗中，0.5和2.5mg/kg劑量組CD4+T細胞在3種濃度S1P條件下均出現趨化功能明顯降低，CD8+T在1和10nmol/LS1P濃度處理下出現趨化功能受損，100nmol/LS1P處理下功能的降低僅在2.5mg/kg劑量組出現。研究結果顯示，CD4+T細胞和CD8+T細胞針對不同濃度S1P的趨化功能，受到THI染毒劑量和染毒周期的影響，本實驗為進一步開展THI相關研究時設置的染毒劑量、染毒時間和設置的S1P濃度條件，合理選擇細胞類型提供了依據。

從THI連續染毒7d和30d實驗結果來看，THI可以抑制小鼠的細胞免疫功能，引起血液淋巴細胞減少，胸腺中單陽性T細胞增加、T細胞趨化功能受損等。染毒劑量為0.5mg/kg條件下，當染毒時間從7d延長至30d時，會表現出7d染毒實驗中未出現的免疫抑制作用，說明THI的毒性作用具有劑量和時間依賴性。在本研究中，THI連續染毒30d，0.2mg/kg劑量組未出現明顯毒性作用，且有研究表明，略高于0.2mg/kg劑量THI連續染毒30d不會引起小鼠胸腺組織病理樣改變[17-19]，可初步認為0.2mg/kg是小鼠THI連續暴露30d的NOAEL水平，但是否是小鼠THI作用的安全劑量，還需要更長染毒時間的毒性研究進一步確認。