Camk2b低表達對1,4-苯醌致K562細胞線粒體毒性的影響

張 虹，王 彤，王 坤，王博深，章夢瑩，周燕華，浦躍樸，張 娟*

(東南大學公共衛生學院，環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009)

苯是一種常見的工業基本原料，也是環境中重要的污染物，苯通過不同途徑進入機體后，經過一系列代謝，最后在骨髓生成終致癌物1,4-苯醌(1,4-benzoquinone，1,4-BQ)[1-2]。慢性苯暴露可影響骨髓造血功能，引起白細胞減少，再障，骨髓增生異常綜合征，甚至白血病[3-6]。1,4-BQ可以誘導K562細胞活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)增加，導致線粒體損傷和細胞凋亡增加[7]。鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶2(calcium/calmodulindependentproteinkinase2，Camk2)是一種多功能蛋白激酶，能夠根據Ca2+濃度的改變傳遞不同的細胞信號[8-9]，細胞內鈣離子的超載會造成線粒體功能障礙，從而導致細胞凋亡[10]。本課題組前期研究發現，苯暴露可致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷小鼠骨髓細胞Camk2b的表達降低[11]，故本研究通過構建Camk2b低表達K562細胞，在不同濃度的1,4-BQ染毒后檢測細胞增殖、活性氧、ATP、線粒體膜電位、凋亡的改變，探討Camk2b低表達對苯致K562細胞線粒體毒性的影響，初步研究Camk2b對于細胞抗氧化損傷的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

K562細胞株，購自中國科學院上海細胞庫。RPMI-1640培養基、胎牛血清均購于美國Gibco公司。青霉素、鏈霉素均購于美國Hyclone公司。PrimeScriptTMRTMasterMix、SYBR?PremixExTaqTM均購于日本TaKaRa公司。活性氧檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、Fluo-3AM鈣離子熒光探針均購于上海碧云天公司。ATP檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購于江蘇凱基公司。Anti-CamkⅡbeta antibody、Anti-betaActinantibody均購于美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光定量PCR法檢測K562細胞Camk2b mRNA水平的表達 選取狀態良好的K562細胞，用含有5%(體積分數)血清和0.5%(體積分數)雙抗的1640培養基重懸，以每孔3×105個細胞、2mL培養液接種于6孔板。分別以0、10、20μmol/L1,4-BQ染毒，每個濃度設置3個平行，培養24h，收集細胞后加入Trizol提取RNA，引物序列見表1，逆轉錄(體系為500ngRNA，20 μL5×PrimeScriptRTMastermix，無酶水補充至體系總體積為20μL)后進行熒光定量PCR反應，反應條件為：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；共40個循環。以β-actin為內參，用 2-ΔΔCT法計算Camk2bmRNA的相對表達水平。

表1 基因引物序列

1.2.2 熒光定量PCR法檢測KN93干預細胞Camk2b mRNA表達水平 根據參考文獻[12-13]及預實驗，選擇15μmol/L濃度的抑制劑KN93干預細胞，設置3個平行，培養24h。收集細胞后加入Trizol提取RNA，引物序列同表1，逆轉錄及熒光定量PCR反應同1.2.1。 以 β-actin 為 內參， 用 2-ΔΔCT法計算Camk2b mRNA的相對表達水平。

1.2.3 Westernblot法檢測KN93干預細胞Camk2b蛋白的表達水平 以15μmol/L濃度的抑制劑KN93干預細胞，設置3個平行，培養24h。收集細胞后加入RIPA提取蛋白，通過BCA法檢測蛋白濃度，取25g蛋白上樣，通過制備濃縮膠和分離膠，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)電泳(條件為70V、30min，100V、60min)，轉膜(條件為90V、3h)，5%脫脂奶粉封閉，分別加入1∶1000稀釋Camk2b的一抗和1∶2000稀釋β-actin的一抗4℃孵育過夜，1×TBST緩沖液清洗后用1∶5000稀釋的二抗孵育1h，1×TBST和1×TBS緩沖液清洗后曝光，測定細胞蛋白表達量。

1.2.4 細胞分組及處理 將Camk2b低表達細胞和對照細胞分別以0、10、20μmol/L1,4-BQ染毒，共分為 0、 10、 20 μmol/L1,4-BQ， KN93， KN93+10 μmol/L，KN93+20μmol/L1,4-BQ共6個組，每個組設置3個平行，抑制劑KN93提前1h加入。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖抑制率 以每孔8000個細胞、200μL培養液的濃度接種于96孔板，分組同1.2.4，每組設置3個平行，同時用培養基設置空白對照組，用PBS加在各組最外圈防止邊緣效應，各實驗組細胞分別培養24h。干預24h后每孔加入20μL MTT溶液，繼續在培養箱中培養4h，然后將96孔板以1500r/min離心10min，去上清，每孔加入150 μLDMSO溶液溶解藍紫色結晶，在490nm波長測定吸光度D(490)值，按公式計算細胞相對增殖率。

1.2.6 細胞活性氧檢測 按照1∶1000的稀釋比用無血清培養基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，培養2h后每個平行收集1×105個細胞，1500r/min離心，5min，去除上清。將離心后的細胞重懸于稀釋后的DCFH-DA中，細胞濃度為1×106/mL，置于37℃培養箱中孵育20min。在孵育期間，每隔3～5min顛倒混勻一下，使細胞和探針充分接觸。孵育結束后，洗滌細胞3次，1500r/min離心5min，盡快上機檢測。

1.2.7 細胞ATP檢測 細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，培養24h后每個平行收集2×105個細胞并離心，棄上清，每2×105個細胞加入200μL裂解液，待裂解充分后，4℃、12000g離心5min，輕輕吸取上清待用。將ATP標準溶液稀釋成0.01、0.05、0.2、1、5、10和50μmol/L幾個濃度，用于測定標準曲線。按照ATP檢測試劑：ATP檢測試劑稀釋液=1∶9的比例配制適當量的ATP檢測工作液，每個樣品/標準品100μL。在檢測孔內加上40μL樣品和標準品，迅速混勻，間隔3s后，用微孔板式發光檢測儀檢測。

1.2.8 細胞JC-1膜電位檢測 用超純水稀釋溶解并混勻JC-1，再加入2mLJC-1染色緩沖液(5X)，配制染色工作液。細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，染毒結束24h后，每個平行收集2×105個細胞重懸于0.5mL細胞培養液中，再加入0.5mLJC-1染色工作液，混勻，37℃孵育20min。按照JC-1染色緩沖液(5X)∶蒸餾水=1∶4的比例，配制JC-1染色緩沖液(1X)，冰上保存。37℃孵育結束后，600g、4℃離心3～4min，棄上清，用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌細胞，600g、4℃離心3min，再重復洗滌一次。用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸細胞，盡快用流式細胞儀檢測。綠色熒光值越高，細胞線粒體膜電位越低。

1.2.9 細胞內鈣離子濃度檢測 細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，染毒24h后每個平行收集等量的細胞，離心5min，棄上清。將5mmol/L的Fluo-3AM熒光探針用DMSO稀釋成5μmol/L待用，注意避光保存。Fluo-3可以和鈣離子結合，結合鈣離子后可以產生較強的熒光。用稀釋好的5μmol/L的Fluo-3AM熒光探針重懸細胞，37℃孵育50min，無菌PBS洗滌細胞，再孵育20min，盡快用流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度。

1.2.10 細胞凋亡率檢測 細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，染毒24h后每個平行收集(1～5)×105個細胞，1500r/min離心5min，PBS洗滌兩次，1500r/min離心5min。每個平行加入500μL的BindingBuffer和5μLAnnexinV-PE混勻后，加入5μLPI染液混勻，室溫、避光、反應5～15min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。AnnexinV是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標，用熒光素APC標記；PI是一種核酸染料，能透過晚期凋亡細胞和死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。AnnexinV陽性PI陰性為早期凋亡細胞，AnnexinV和PI雙陽性為晚期凋亡細胞。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 K562細胞Camk2bmRNA水平的表達

通過qPCR法檢測Camk2bmRNA的表達，結果如圖1所示，在1,4-BQ染毒后，與未染毒組比較，K562細胞Camk2bmRNA表達量明顯下降，呈劑量反應關系，差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 1,4-BQ染毒K562細胞后Camk2bmRNA的相對表達水平

2.2 KN93干預后K562細胞Camk2bmRNA水平的表達

通過qPCR法檢測Camk2bmRNA的表達，在15 μmol/LKN93干預后，K562細胞Camk2bmRNA表達量與對照組比較，下降71%，差異有統計學意義(P＜0.01)，如圖2所示。

圖2 KN93干預K562細胞后Camk2bmRNA的相對表達水平

2.3 KN93干預后K562細胞Camk2b蛋白水平的表達

通過Westernblot法檢測Camk2b蛋白表達的結果如圖3所示，在15μmol/LKN93干預后，K562細胞Camk2b蛋白表達量與對照細胞比較，下降46%，差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖3 KN93干預K562細胞后Camk2b蛋白的相對水平表達

2.4 KN93干預對苯致K562細胞增殖活性的影響

MTT實驗結果如圖4所示，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞和對照細胞都出現明顯的增殖抑制作用，且呈劑量反應關系。與對照細胞相比，Camk2b低表達細胞在相同濃度1,4-BQ作用下細胞增殖率降低(P＜0.01)。

圖4 KN93對苯致K562細胞增殖活性的影響

2.5 KN93干預對苯致K562細胞ROS的影響

流式細胞術檢測結果如圖5所示，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞和對照細胞產生的ROS均增加，在10μmol/L的濃度下ROS上升為原來的1.41倍和1.6倍，Camk2b低表達細胞的活性氧上升更為明顯(P＜0.05)。在20μmol/L的濃度下，對照細胞產生的活性氧仍在上升，而Camk2b低表達細胞產生的活性氧則開始下降，但仍然高于未染毒細胞。

圖5 流式細胞術檢測Camk2b抑制劑KN93對苯染毒后K562細胞ROS的影響

2.6 KN93干預對苯致K562細胞ATP的影響

用微孔板式發光檢測儀檢測細胞線粒體的ATP生成量，如圖6所示。Camk2b低表達細胞線粒體ATP生成量低于對照細胞(P＜0.01)。在1,4-BQ染毒后，兩種細胞線粒體ATP生成量均降低，且呈劑量反應關系。但在相同濃度1,4-BQ染毒后，與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞線粒體ATP生成量更低(P＜0.01)。

圖6 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞ATP生成量的影響

2.7 KN93干預對苯致K562細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測結果如圖7所示，相較于對照細胞，Camk2b低表達細胞的綠色熒光值更高，提示Camk2b抑制劑KN93干預后，線粒體膜電位下降(P＜0.01)。隨著1,4-BQ染毒濃度的增加，紅色熒光減弱，綠色熒光增強，紅綠熒光比值降低，說明兩種細胞線粒體膜電位均降低，且呈劑量反應關系。在10 μmol/L1,4-BQ染毒后，與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞線粒體膜電位下降更顯著(P＜0.05)。但在20 μmol/L1,4-BQ染毒后，兩種細胞線粒體膜電位都明顯下降，差異沒有統計學意義。

圖7 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞線粒體膜電位的影響

2.8 KN93干預對苯致K562細胞內鈣離子濃度的影響

流式細胞術檢測結果如圖8所示，Camk2b低表達細胞內的鈣離子濃度高于對照細胞(P＜0.01)。在1,4-BQ染毒后，兩種細胞內鈣離子濃度均增加，且呈劑量反應關系，但在相同濃度1,4-BQ染毒后，與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞內鈣離子濃度更高(P＜0.01)。

2.9 KN93干預對苯致K562細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果如圖9所示，Camk2b低表達細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率都高于對照細胞，提示抑制Camk2b基因后細胞凋亡明顯增加。在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞和對照細胞的晚期凋亡率都增加，且呈劑量反應關系，而且與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞在相同濃度1,4-BQ染毒后晚期凋亡率更高。而Camk2b低表達細胞早期凋亡率在20 μmol/L的濃度開始下降，由早期凋亡逐漸轉變為晚期凋亡。

3 討論

線粒體主要功能是高效地為細胞生命活動的提供能源ATP與細胞中氧自由基的生成，調節細胞氧化還原電位和信號轉導、細胞內多種離子的跨膜轉運及電解質穩態平衡，調控細胞凋亡[14-15]。線粒體損傷主要表現在氧化磷酸化障礙，ATP生成受阻，膜電位降低，鈣離子濃度失衡，導致細胞凋亡或壞死[16-17]。

圖8 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞內鈣離子濃度的影響

圖9 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞凋亡的影響

本次研究中，首先發現在1,4-BQ染毒后，K562細胞Camk2bmRNA表達量下降。建立Camk2b低表達細胞模型，發現在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達與對照細胞增殖都受到明顯的抑制，ATP生成減少，線粒體膜電位下降，產生的活性氧增加，出現明顯的線粒體損傷。Camk2b低表達細胞由于鈣/鈣調素依賴蛋白激酶受到抑制，在20μmol/L1,4-BQ染毒后，ATP生成急劇減少，線粒體膜電位顯著下降，胞內鈣離子過載，表現為更加明顯的線粒體損傷。適當濃度的ROS是細胞正常生理過程所必須的，過度的ROS產生可能導致細胞功能障礙或死亡[18]。本研究中1,4-BQ染毒后ROS顯著升高，可引起過度的氧化應激，但20 μmol/L1,4-BQ染毒之后，Camk2b低表達細胞與正常表達組相比，ROS水平出現下降，這可能與高濃度1,4-BQ對線粒體有氧呼吸的抑制有關。

鈣離子是普遍存在的參與控制多種生理過程的第二信使，通過抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白微調細胞內鈣離子的穩態[19]。鈣離子的過載導致細胞活性氧的產生增加以及線粒體鈣離子循環可能通過通透性轉換孔的開放導致線粒體去極化，最終導致線粒體功能障礙和細胞凋亡，產生不利影響[20-21]。細胞內鈣濃度的變化調節細胞信號傳導過程，包括細胞增殖，遷移和死亡[22]。有研究顯示，Camk2b具有廣泛的生物學功能，是細胞增殖的重要調節因子[23]，抑制Camk2b的活性會限制白血病細胞的增殖，并導致生長停滯和分化[24]。本研究顯示在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞會出現更高的細胞凋亡率和增殖抑制率。

綜上所述，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞出現更明顯的線粒體損傷，Camk2b對于細胞的抗氧化損傷具有重要意義。