S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯含量測(cè)定

余雙英 劉璐 張軍東

摘 要 建立氣相色譜法測(cè)定S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法以正己烷為萃取劑，采用了聚乙二醇毛細(xì)管柱Agilent DB-WAX（30 m×0.53 mm×1 mm）、氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）進(jìn)行檢測(cè)。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法專屬性良好，線性范圍為0.034 1～0.102 4 mg/ml；中間精密度所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD僅為1.09%（n=12）；以80%、100%、120%濃度水平測(cè)定的平均回收率分別為99.38%、95.66%、99.13%，9組準(zhǔn)確度溶液測(cè)得回收率的總平均值為98.06%（n=9），RSD為2.72%（n=9）。該方法專屬性較強(qiáng)，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性良好，可作為S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯的含量測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞 氣相色譜 豬血漿 磷酸三丁酯 含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R927.11； R982 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）13-0065-03

Determination of the tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma by gas chromatography

YU Shuangying*， LIU Lu， ZHANG Jundong**

（ Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT A gas chromatography method for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma was established. Gas chromatography was performed using n-hexane as an extractant by a hydrogen flame ionization detector （FID） on an Agilent DB-WAX column （30 m×0.53 mm×1 mm）. The results of methodological verification showed that the method had good specificity with a linearity over the range of 0.034 1-0.102 4 mg/ml. The relative standard deviation （RSD） obtained from the intermediate precision was only 1.09% （n=12）. The average recovery rates from three samples at different concentrations （80%， 100%， 120%） were 99.38%， 95.66%， 99.13%， respectively. The total recovery rate was 98.06% （n=9） with RSD 2.72% （n=9）. This method has good specificity， precision， accuracy and stability and can be used for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma.

KEy WORDS gas chromatography； pig plasma； tributyl phosphate； content determination

豬源纖維蛋白黏合劑主要是由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應(yīng)的溶解液組成的一種復(fù)合制劑，臨床常用于術(shù)中輔助止血[1]，生物相容性好、無毒無刺激，能有效黏附于創(chuàng)口起到良好的止血和促進(jìn)創(chuàng)口愈合的作用[2-6]。為提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低該類產(chǎn)品傳播動(dòng)物病毒的風(fēng)險(xiǎn)，本公司參照《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中“有機(jī)溶劑/去污劑（S/D）處理法”[1，7]對(duì)豬血漿進(jìn)行病毒滅活，其中所用的有機(jī)溶劑為磷酸三丁酯。因此，在實(shí)際生產(chǎn)工藝中，為保證病毒滅活效果，提高終產(chǎn)品的臨床使用安全性，磷酸三丁酯的質(zhì)量控制十分重要。

本方法主要參考中國(guó)藥典2015年版四部磷酸三丁酯殘留量測(cè)定法[8]，并適當(dāng)進(jìn)行了改進(jìn)。其測(cè)定原理為：利用高氯酸將血漿中的蛋白進(jìn)行沉淀，用正己烷萃取溶液中的磷酸三丁酯和磷酸三丙酯，離心，取上層清液，利用配置氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）的氣相色譜儀測(cè)定磷酸三丁酯含量。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬血漿（公司自產(chǎn)，批號(hào)：20170207、20170209、20170210）；磷酸三丁酯和磷酸三丙酯（對(duì)照品，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；高氯酸和磷酸三丁酯（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（HPLC級(jí)，海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；聚山梨酯-80（藥用級(jí)，湖南華日制藥有限公司）。

1.2 儀器

7890B氣相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；ME104分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合器（Scientific Industries公司）；H1650臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司）。

1.3 色譜條件

Agilent DB-WAX聚乙二醇毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm×1 mm）；進(jìn)樣口溫度190 ℃，無分流模式；進(jìn)樣量1 ml；FID檢測(cè)器溫度210 ℃，空氣400 ml/min，氫氣40 ml/min，氮?dú)?5 ml/min；于160 ℃運(yùn)行15 min。

1.4 溶液及樣品配制

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（400 mg/ml）：精密稱重磷酸三丙酯對(duì)照品40 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻。

對(duì)照品溶液：精密稱重磷酸三丁酯對(duì)照品60 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，混勻，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液（600 mg/ml）。精密量取0.5 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液、0.5 ml內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液和3.5 ml正己烷，混勻，即得（STD溶液）。

樣品溶液：稱取一定質(zhì)量的血漿于燒杯中，加入血漿質(zhì)量比3%的聚山梨酯80，攪拌至完全溶解，再加入血漿質(zhì)量比3%的磷酸三丁酯，混勻后，取6 ml于100 ml容量瓶中，用純化水定容，作為樣品儲(chǔ)備液（S/D滅活血漿）。準(zhǔn)確量取0.5 ml樣品儲(chǔ)備液和0.1 ml高氯酸溶液（1.5 mol/L）于10 ml離心管中，振蕩混勻，于37℃水浴10 min，冷卻至室溫，再加入0.5 ml內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液和4 ml正己烷，混勻后，3 000 r/min離心20 min，吸取上層清液進(jìn)樣分析。

空白基質(zhì)：同上配制不含磷酸三丁酯的空白基質(zhì)溶液。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 專屬性

分別取按照1.4項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品溶液（STD溶液）、空白基質(zhì)和正己烷（空白溶液）適量于進(jìn)樣瓶中，按照1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。空白溶液、空白基質(zhì)和對(duì)照品溶液色譜圖見圖1。

1.5.2 線性

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液（600 mg/ml）0.75、0.60、0.5、0.4和0.25 ml于離心管中，再分別加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（400 mg/ml）0.5 ml和相應(yīng)體積的正己烷，使得各線性溶液總體積均為4.5 ml，混勻后，按照1.3項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣1次。以各磷酸三丁酯對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比，對(duì)磷酸三丁酯對(duì)照品濃度作線性回歸，求得直線回歸方程。

1.5.3 準(zhǔn)確度

取9支10 ml離心管，每3支為一組，分別加入0.25 ml樣品儲(chǔ)備液，再分別加入0.20 ml、0.25 ml、0.30 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液，再各加入0.1 ml高氯酸溶液，振蕩混勻，置于37 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，加入0.5 ml內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液和4 ml正己烷，混勻后，3 000 r/min離心20 min，取上層清液，按照1.3項(xiàng)下色譜條進(jìn)樣分析，分別命名為R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3、R120%-1～R120%-3。

1.5.4 精密度（重復(fù)性/中間精密度）

在不同的日期，由兩位研究員分別按照1.4項(xiàng)下的樣品制備方法平行制備6份樣品溶液，并按照1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，比較兩位研究員測(cè)定結(jié)果，并計(jì)算12組結(jié)果的RSD。

1.5.5 溶液穩(wěn)定性

取樣品溶液和對(duì)照品溶液（STD溶液），放置在室溫條件下，以預(yù)定的時(shí)間間隔進(jìn)樣分析，計(jì)算溶液在不同時(shí)間點(diǎn)和0時(shí)間點(diǎn)磷酸三丁酯含量的比值。

1.5.6 耐用性

固定其他色譜條件或樣品處理方法不變，實(shí)驗(yàn)方法發(fā)生微小變動(dòng)，如調(diào)整離心轉(zhuǎn)速為（3 000±500）r/min、調(diào)整柱溫為（160±2）℃、選用兩種不同批次的色譜柱、調(diào)整載氣流速為（8.0±0.2）ml/min，考察其耐用性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

空白溶液和空白基質(zhì)在磷酸三丁酯峰的保留時(shí)間（約11.3 min）處均沒有干擾，內(nèi)標(biāo)物均出峰正常（約4.9 min），說明該方法專屬性良好（見圖1）。

2.2 線性

線性方程為y=25.829 3x-0.063 8，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（r≥0.990）。

2.3 準(zhǔn)確度

3組不同濃度樣品的回收率分別為99.38%、95.66%、99.13%，9組樣品的總平均回收率為98.06%（n=9），RSD為2.72%（n=9），滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（RSD≤5.0%）（表1）。

2.4 精密度（重復(fù)性/中間精密度）

兩位實(shí)驗(yàn)員測(cè)得12份樣品中磷酸三丁酯含量的平均值為10.41 mg/ml，RSD為1.09%（n=12），結(jié)果滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（RSD≤5.0%）（表2）。

2.5 溶液穩(wěn)定性

對(duì)照品和樣品溶液于室溫放置48 h后，在各相應(yīng)穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)磷酸三丁酯含量與0時(shí)間點(diǎn)測(cè)得含量的比值均在95.0%～105.0%之間，說明樣品和對(duì)照品穩(wěn)定性良好（表3）。

2.6 耐用性

各參數(shù)微調(diào)后測(cè)得結(jié)果與正常條件下測(cè)得磷酸三丁酯含量的比值均在95.0%～105.0%，滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（95.0%～105.0%），說明該方法耐用性良好（表4）。

2.7 樣品檢測(cè)

取3批豬血漿（批號(hào)：20170207、20170209、20170210），按照1.4項(xiàng)下樣品制備方法進(jìn)行處理，并按照1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定磷酸三丁酯含量分別為10.41、10.38和10.45 mg/ml。

3 討論

與藥典[8]和文獻(xiàn)方法[9-10]相比，本方法在樣品處理時(shí)增加了正己烷與供試品的體積比，可以提高磷酸三丁酯和磷酸三丙酯的萃取效率，并增大了離心轉(zhuǎn)速，可以使蛋白快速沉淀；數(shù)據(jù)處理方式上，藥典方法采用線性方程計(jì)算，本方法采用單點(diǎn)法計(jì)算，縮短了分析測(cè)定時(shí)間，從而可以提高工作效率。該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、精密度較好，可以用于測(cè)定S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯含量。

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