當歸芍藥散加味方對乳腺增生大鼠sFas及Fas／FasL表達的影響

張婷婷，王 蘋，張建偉

（福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州350122）

當歸芍藥散出自《金匱要略方論》，由當歸、芍藥、川芎、茯苓、白術、澤瀉組成，全方從肝脾入手，意在使肝氣條達，脾氣健運，肝脾同調，氣血兩和，虛實兼顧，為調和肝脾類方之祖，又有氣血濕（痰）同治之妙。通過前期的研究基礎表明，乳腺增生病各證型間凋亡指數和相關凋亡基因的表達有一定的差異性；從肝脾著眼活血散結治療乳腺增生病在改善臨床癥狀、縮小腫塊方面確實有效，并可通過影響乳腺組織上皮細胞增殖和凋亡過程達到一定的干預治療目的。因此，本實驗在前期研究基礎上，緊扣乳腺增生病的病機，以乳腺增生模型動物為觀察對象，觀察當歸芍藥散加味方對實驗動物血清sFas、Bcl-2和乳腺組織Fas、FasL表達的影響，目的在于闡明該方是否通過干預乳腺增生組織Fas／FasL系統來抑制乳腺組織細胞增生，促進細胞凋亡，從而抑制／逆轉乳腺增生，降低增生程度，為拓展經方應用范圍和經方開發、研制提供一定的科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60只SPF級SD雌性健康未孕大鼠，10周齡，體質量（193.78±5.78）g，購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗場所福建中醫藥大學動物實驗中心。

1.2 實驗藥物 當歸芍藥散加味方組成：當歸15g，芍藥15g，川芎8g，茯苓10g，白術15g，澤瀉10g，浙貝母12g，柴胡8g，香附12g，丹參15g，由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院藥房提供。將生藥經蒸餾水浸泡1h，文火煎煮2次，每次60 min，取汁合并，4層紗布過濾2次，70～80℃水浴濃縮為240%濃度的藥液（含生藥1 g／mL），冰箱儲存備用。乳消Ⅲ膠囊溶于生理鹽水，由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院制劑科提供（院內制劑）。

1.3 實驗試劑 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業股份有限公司）；黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份公司）；10%水合氯醛溶液、中性樹膠、多聚賴氨酸、sFas和Bcl-2 ELISA試劑盒、Fas和FasL SABC試劑盒、PBS緩沖液、蘇木素染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模 適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組12只、實驗組48只。實驗組采用雌、孕激素序貫法造模，按體質量0.5mg／（kg·d）于大鼠后肢后外側肌肉注射苯甲酸雌二醇，每日1次，左右交替，連續25 d；繼而用黃體酮5mg／（kg·d）注射，每日1次，連續5 d。正常對照組肌肉注射生理鹽水0.1mL／只，每日1次，連續30 d。

2.2 分組與干預雌、孕激素聯合給藥造模完成后，實驗組再隨機分為模型1組、模型2組、當歸芍藥散加味方組、乳消Ⅲ膠囊組，每組12只。模型1組，斷頭處死，取下第二、三對乳房組織，經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋制片后，觀察造模是否成功，另外也與實驗結束后模型2組進行比較，觀察增生的乳腺組織是否存在自我復舊；模型2組與正常對照組大鼠均按1mL／（kg·d）予生理鹽水灌胃；當歸芍藥散加味方組按1 g／（kg·d）予當歸芍藥散加味方藥液灌胃；SD大鼠中劑量是成人劑量的6.25倍，按15粒／（成人·d）計，乳消Ⅲ膠囊組按1.5625粒／（kg·d）予乳消Ⅲ膠囊藥液灌胃，每組均連續灌胃30 d。

2.3 標本采集 大鼠灌胃30 d后，禁食24h，通過隨機抽取方式，每組隨機取8只實驗大鼠進行標本采集與指標檢測。運用腹腔注射麻醉藥的方法，予10%水合氯醛（1mL／kg）麻醉后，腹主動脈取血4mL，加入肝素抗凝，待做血清檢測。取血后處死大鼠，經乳頭向基底部最大面積取下第二對完整乳房組織，10%福爾馬林溶液固定，等待做組織學和免疫組化檢測。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 病理學觀察 常規取材后，通過固定、脫水、石蠟包埋切片、HE染色，在光學顯微鏡下對乳腺組織切片進行觀察。

2.4.2 ELISA法檢測血清sFas、Bcl-2表達 腹主動脈取血4mL加入肝素鈉抗凝，混合均勻，1000 r／min后收集血清，置-80℃冰箱儲存備用，收集血液的試管及器皿均去熱源和內毒素，標本無溶血及絮狀沉淀，采用ELISA法檢測sFas、Bcl-2，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.4.3 免疫組化SABC法檢測乳腺上皮組織Fas、FasL表達 取大鼠第二對乳房，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色后，應用免疫組化SABC法檢測大鼠乳腺組織Fas、FasL陽性表達情況，采用Olympus（BH-2）照相顯微鏡觀察并攝片。

2.5 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，采用t檢驗。

3 結果

3.1 大鼠乳腺組織形態學變化 在鏡下可見，正常對照組保持靜息期狀態，主要呈現脂肪族和結締組織，腺管、腺泡數量、大小均正常；模型1組和模型2組大鼠的乳腺組織與正常對照組比較，乳腺導管上皮出現了明顯的增生，乳腺導管擴張，乳腺腺泡及小葉數量增多，部分大的乳腺導管腔內還可以見到部分脫落的上皮細胞或者嗜酸性分泌物，2組乳腺組織無明顯差異，說明模型2組在停止造模后沒有自愈傾向；當歸芍藥散加味方組和乳消Ⅲ膠囊組與模型組比較，增生程度均有明顯改善，乳腺腺泡和導管上皮增生程度有明顯改善，但從顯微鏡下觀察來看2組無明顯差異。見圖1。

圖1 5組大鼠乳腺組織形態學HE染色（×100）

3.2 5組大鼠血清sFas和Bcl-2濃度比較 見表1。

表1 5組大鼠血清sFas和Bcl-2濃度比較（±s） μg／L

表1 5組大鼠血清sFas和Bcl-2濃度比較（±s） μg／L

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型2組比較，2）P＜0.01；與乳消Ⅲ膠囊組比較，3）P＜0.01。

組別正常對照組模型1組模型2組乳消Ⅲ膠囊組當歸芍藥散加味方組n 88888 sFas 1.06±0.5312.42±3.681）12.63±3.321）6.92±1.421）2）6.07±2.061）2）Bcl-21.01±0.022.09±0.061）2.07±0.061）1.70±0.021）2）1.52±0.021）2）3）

3.3 5組大鼠乳腺組織Fas和FasL蛋白陽性表達率比較 見圖2、圖3、表2。

4 討論

乳腺增生病在臨床多見女性發病，病程長，反復發作，有一定惡變傾向。臨床上本病常見病機有：肝氣郁滯、肝郁脾虛、肝腎虧虛、沖任失調，同時也有氣滯、痰阻、血瘀等病理變化。中醫治療本病的方式多樣，在緩解患者臨床癥狀及降低惡變率方向有良好的作用［1-2］。目前臨床治療有內治法和外治法，內治法緊扣乳腺增生病的發病病機，通過疏肝、健脾、補腎、調補沖任及活血、化痰、散結為大法；外治法包括了針灸、局部乳房按摩、外用膏藥敷貼等，均有確切的療效。

目前中藥治療乳腺增生病多從肝、腎角度入手，以行氣、活血、散結為主。本課題組在前期研究發現，本病可從肝脾入手，痰瘀同治，擬定《金匱要略》當歸芍藥散為主方，加味運用于臨床療效顯著，同時還用此方開展了多項動物實驗研究，探討本方治療乳腺增生病的作用機理。當歸芍藥散加味方是在原方的基礎上加入了柴胡、香附、丹參、浙貝母，既可增強疏肝解郁、理氣活血的力度，又能加強化痰散結之功，使得全方更符合乳腺增生病之肝脾失調、痰瘀互結乳絡的病機特點。

近幾年來，關于本病在動物模型研究方面，①模型動物的選擇方面［3］：篩選復制率高、周期短、生存周期長、經濟成本合適的實驗動物，比如目前常用于實驗的動物有SD大鼠、Wistar大鼠、豚鼠、昆明小鼠、新西蘭兔等；②中醫證型的動物模型復制：如賈敏等［4］運用了復合造模的方法建立了肝郁氣滯證的乳腺增生模型大鼠，這種模型塑造更為符合中醫的研究特點。

圖2 大鼠乳腺組織Fas免疫組化圖（×400）

圖3 大鼠乳腺組織FasL免疫組化圖（×400）

表2 大鼠乳腺組織Fas和FasL蛋白陽性表達率比較（±s）%

表2 大鼠乳腺組織Fas和FasL蛋白陽性表達率比較（±s）%

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與模型2組比較，2）P＜0.05；與乳消Ⅲ膠囊組比較，3）P＜0.05。

組別正常對照組模型1組模型2組乳消Ⅲ膠囊組當歸芍藥散加味方組n 88888 Fas 71.56±14.1133.50±12.681）36.71±11.951）51.71±14.081）2）55.75±16.611）2）3）FasL 46.39±8.1866.96±10.741）67.75±9.351）58.04±6.231）2）56.20±7.161）2）3）

Fas／FasL系統包括了Fas、FasL和sFas三種形式，在人體內適當的表達對機體的平衡穩定發揮重要作用，但若該系統調節失常，則會引發組織增生惡變或者是組織間相互致死。Fas／FasL系統調控主要集中于免疫和腫瘤凋亡相關方面，其調控異常導致了細胞凋亡受抑制，機體的免疫監控機制出現監控失常，腫瘤細胞就出現了逃逸現象，逃避機體的免疫監控［5－6］。我們從近年來的文獻報道上看，該系統的研究運用于乳腺疾病方面涉及的多是乳腺癌的相關研究，有乳腺癌的發病機制探討、預后轉歸的判斷及動物實驗研究，部分學者將此通路系統運用于乳腺增生疾病中，但報道相對較少。

我們在前期實驗設計中就猜想，當歸芍藥散加味方在治療乳腺增生病的作用機制是否通過調控機體內的細胞凋亡來達到治療本病的作用，所以本實驗檢測Fas／FasL系統中Fas、FasL、sFas的表達和Bcl-2基因表達。實驗結果顯示，Fas／FasL系統在正常的大鼠乳腺組織中有表達，其特點是Fas高表達，FasL、sFas表達較低；而復制乳腺增生病模型大鼠體內則是Fas表達降低，FasL、sFas表達增高；經過藥物干預后，當歸芍藥散加味方組在增加Fas在乳腺組織中的表達、降低FasL和sFas的表達優于乳消Ⅲ膠囊組。另外，從Bcl-2表達情況看，在模型組中高表達，通過藥物治療后表達下降。從本實驗結果推測，當歸芍藥散加味方對乳腺增生組織Fas／FasL系統有一定干預作用，通過提高Fas和降低FasL的表達，抑制乳腺組織上皮細胞的增生，促進細胞凋亡，從而達到抑制／逆轉乳腺增生的作用。然而本動物實驗研究周期相對較短，對于實驗結果的表現是否是素體本身內在一系列基因的激化、表達及自我調控的結果，或者在時間上有滯后性，這也有待于進一步的研究。