丹參片的超高效液相色譜指紋圖譜

秦學玲，康紹建，馬娜，蔣新平，楊璐璐

丹參片是以唇形科植物丹參為原料而制成的片劑，具有活血化瘀等功效[1]。丹參片對軍事訓練中的急慢性損傷均具有較好的活血化瘀及緩解腫痛的作用。丹參片的主要成分為以丹酚酸B為代表的水溶性成分和以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性成分[2-12]。筆者在前期研究的基礎上，參考相關文獻[2-16]，運用UPLC法對抽到的全部批次丹參片樣品開展了指紋圖譜的研究，建立了丹參片的UPLC指紋圖譜共有模式，確定了13個峰為共有峰，所有樣品的相似度均在0.90以上；指認了其中的11個共有峰。該方法能在30 min內檢測丹參片中的多種成分，操作簡便、快速，可為丹參片的整體質量控制提供參考。

本研究起止時間為2015年2—12月。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 UPLC儀Agilent Technologies 1290 lnfinity系統，(美國安捷倫公司)；天平：AW220電子天平(日本島津公司)；對照品丹參素鈉(批號201403)、迷迭香酸(批號201203)、丹酚酸B(批號201407)、丹參酮ⅡA(批號201409)、原兒茶醛(批號201307)、丹參酮Ⅰ(批號201209)、隱丹參酮(批號201312)、熊果酸(批號201209) 均購自中國食品藥品檢定研究院；紫草酸(批號27342-47-5)、丹酚酸A對照品(批號98361-23-6)、二氫丹參酮Ⅰ對照品(批號68351-80)均購自西亞公司，標示含量均大于99%；乙腈為色譜純，水為高純水(自制)，其它試劑均為分析純；丹參片為從 8個生產廠家抽取的74批次樣品。

1.2 色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，以0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～10 min,4%B→18%B;10～15 min,18%B→33%B;15～19 min,33%B→49%B;19～37 min,49%B→79%B);柱溫19 ℃,樣品管理器溫度3.5 ℃;流速為0.25 mL/min;以丹酚酸B為參照峰，檢測波長280 nm。

1.3 對照品溶液的制備 取丹參素鈉；二氫丹參酮；隱丹參酮；丹參酮Ⅰ；丹參酮ⅡA；熊果酸；原兒茶醛；迷迭香酸；紫草酸；丹酚酸B；丹酚酸A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.713 2、0.075 03、0.160 2、0.090 4、0.180 3、0.300 2、0.083 7、0.399 1、0.330 3、0.499 5、0.413 2 mg/mL的對照品溶液，即得。

1.4 供試品溶液的制備 取供試品適量，除去包衣，研細，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入75%甲醇適量，超聲處理25 min(功率：300 W；頻率：50 kHz)，放冷用75%甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.5 陰性樣品溶液的制備 取由寧夏啟元國藥有限公司提供的陰性樣品，照“1.4”項下的方法制備，即得。

1.6 方法學考察

1.6.1 精密度試驗 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備丹參片樣品溶液，重復進樣6次，參照“1.2”項下色譜條件進行測定，以5號峰(丹酚酸B)為參照峰，計算13個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積相對標準偏差(RSD)。結果表明，13個色譜峰的相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于1.0%。說明該儀器具有較好的的精密度。

1.6.2 重復性試驗 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備6份丹參片樣品溶液，參照“1.2”項下色譜條件進行測定，結果顯示指紋圖譜相似度的值均在0.98以上,13個色譜峰相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于1.0%。說明所建立的方法具有較好的重復性。

1.6.3 穩定性試驗 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備丹參片樣品溶液，參照“1.2”項下色譜條件分別于0、3、6、9、14、22 h內進行測定，結果顯示指紋圖譜相似度值為1,13個色譜峰相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于1.0%。說明，丹參片樣品溶液在室溫放置22 h內比較穩定。

1.7 指紋圖譜的建立

1.7.1 共有峰的歸屬 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備丹參片樣品溶液，取“1.3”項下制備對照品溶液；參照“1.2”項下色譜條件進行測定。指認了11個主要色譜峰，從左到右依次為：丹參素鈉(1號峰)、原兒茶醛(2號峰)、迷迭香酸(3號峰)、紫草酸(4號峰)、丹酚酸B(5號峰)、丹酚酸A(6號峰)、二氫丹參酮Ⅰ(8號峰)、丹參酮Ⅰ(9號峰)、隱丹參酮(10號峰)、熊果酸(11號峰)、丹參酮ⅡA(13號峰)。

1.7.2 指紋圖譜共有模式的建立及數據處理 對所抽到的8個生產廠家74批次丹參片樣品進行測定，生成丹參片的指紋圖譜共有模式，詳見圖1～9。并對74批丹參片樣品UPLC指紋圖譜進行了分析，以丹酚酸B為參照峰S，確定了13個峰為共有峰,計算其相似度，詳見表1,2。

2 結果

(1)通過對不同企業指紋圖譜的建立與分析可知(詳見圖2和表1)，供試品色譜圖的相似度均在0.9以上。其中E企業樣品相似度最好(相似度：0.998)，說明其產品質量控制較好，而C企業樣品相似度相對較差(相似度：0.901)，說明其產品質量控制相對較差。

(2)通過對同一企業不同批次間指紋圖譜的建立與分析可知(見圖3～9和表2)，供試品色譜圖的相似度均在0.900以上，均符合規定，合格率為100%。其中E企業各批次間的樣品相似度最好，其相似度范圍為0.998～1.000，說明其整個過程中批次間產品質量控制較好，而C企業各批次間的樣品相似度相對較差，其相似度范圍為0.910～1.000，說明其整個過程中批次間產品質量控制較差，這與前期調研和提取工藝的研究結果基本一致。

(3)本研究建立的方法能在30 min內檢測丹參片中的多種成分，操作簡便、快速，具有較好的專屬性和穩定性，可為丹參片的整體質量控制提供參考。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 本實驗在前期研究的基礎上，參考相關文獻[2-16]，最后確定供試品溶液制備方法為：取供試品適量，除去包衣，研細，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入75%甲醇適量，超聲處理25 min(功率：300 W；頻率：50 kHz)，放冷，用75%甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，用0.2 μm微孔濾膜濾過，即得。

圖1 丹參片UPLC圖譜(共有模式)：A為混合對照品，B為丹參片樣品，C為陰性樣品

圖2 8個不同生產企業丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖3 企業A丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖4 企業B丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖5 企業C丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖6 企業D丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖7 企業E丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖8 企業F不同批次間丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖9 企業G丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

企業名稱相似度數據文件對照圖譜.Scp1.000A企業-280.cdf0.915B企業-280.cdf0.980C企業-280.cdf0.901D企業 -280.cdf0.911E企業 -280.cdf0.998F企業 -280.cdf0.923G企業 -280.cdf0.916H企業 -280.cdf0.991

表2 各企業不同批次間丹參片指紋圖譜相似度范圍分析結果

注：限度規定相似度不得低于0.850

3.2 色譜條件的選擇 本實驗在前期研究的基礎上，參考相關文獻[2-16]，最后確定色譜條件為：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，以0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～10 min,4%B→18%B;10～15 min,18%B→33%B;15～19 min,33%B→49%B;19～37 min,49%B→79%B);柱溫19 ℃,樣品管理器溫度3.5 ℃;流速為0.25 mL/min;以丹酚酸B為參照峰，檢測波長280 nm。

3.3 參照峰的選擇 酚酸性成分是丹參片中一類主要活性成分，其中丹酚酸B為丹參片中酚酸性成分的代表，其在丹參片中的含量最高，并且是2015版中國藥典規定的含量測定項目，因此我們選擇丹酚酸B作為參照峰。

3.4 不足 因H企業只抽到1批次樣品，所以未作批次間指紋圖譜的研究。