二陳合劑質量標準提高△

羅鐳，邵喜英

1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052；2.浙江省腫瘤醫院，浙江 杭州 310022

二陳合劑現行標準收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊(標準編號：WS3-B-1272-93)，處方由陳皮、半夏(姜制)、茯苓、甘草(蜜炙)、生姜五味藥材組成，具有燥濕化痰、理氣和胃之功效，臨床上用于治療咳嗽痰多、胸脘漲悶、惡心嘔吐等[1]。二陳合劑現行標準較簡單，僅收載性狀、裝量、相對密度3個檢測項目，無薄層鑒別及含量測定關鍵質控項目。檢索二陳合劑相關文獻，僅檢索到3篇。魏淑梅等[2]研究制定了二陳合劑的質量標準，文中建立了陳皮、半夏的薄層色譜方法。劉菁等[3]建立了二陳合劑中橙皮苷的高效液相含量測定方法。魏清[4]建立了HPLC同時測定二陳合劑中8種成分的方法。二陳合劑為2017年度國家藥品標準提高品種，在相關文獻[5]基礎上，通過深入研究二陳合劑質量標準，綜合考慮制定標準的簡便性及可重復性，作者建立了二陳合劑中陳皮、甘草的薄層色譜鑒別方法，建立了二陳合劑中橙皮苷的HPLC含量測定方法，橙皮苷的HPLC含量測定方法與劉菁報道的方法有較大不同，在提取溶劑、提取方法等方面進行了優化比較。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20AD型高效液相色譜儀；XPE205分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Elmasonic P型超聲儀(德國Elma公司)；Milli-Q型純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

二陳合劑(批號分別為：170601、160102、160103、160104、150701、150801、150802)由浙江惠松制藥有限公司提供；二陳合劑(批號分別為：18070001、18070002、18070003)由太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司提供；橙皮苷(批號：110721-201617，純度96.1%)、甘草苷(批號：111610-201607，純度93.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院；液相用甲醇為Merck公司色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 陳皮 用量筒量取二陳合劑20 mL置分液漏斗中，加入乙酸乙酯20 mL，充分振搖提取，高速離心使分層，吸取乙酸乙酯層置蒸發皿中，水浴低溫蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另按處方配比制備除陳皮的二陳合劑陰性樣品，按上述方法制備二陳合劑陰性樣品溶液。再取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。分別吸取上面3種樣品溶液各5 μL，點于同一塊用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)4 ℃冰箱放置過夜的下層溶液作為展開劑，展開至約8 cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光(365 nm)下拍照，見圖1。二陳合劑樣品溶液色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯示一個相同顏色的熒光斑點，陰性樣品溶液未顯示該熒光斑點，說明缺味無干擾，方法專屬性強。

注：1.橙皮苷對照品；2.陰性對照；3～9.樣品圖1 二陳合劑中陳皮TLC圖

2.1.2 甘草 取薄層鑒別陳皮項下供試品溶液作為甘草鑒別用供試品溶液。另按處方配比制備除去甘草的陰性樣品，按上述方法制備缺甘草的二陳合劑陰性樣品溶液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述3種溶液各3 μL，點于同一塊用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)混合溶液作為展開劑，展開至8 cm，取出，置通風柜中吹干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，放于紫外光燈(365 nm)下拍照，見圖2。二陳合劑樣品溶液色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯示一個相同顏色的熒光斑點，陰性樣品溶液未顯示該熒光斑點，說明缺味無干擾，方法專屬性強。

注：1.甘草苷對照品；2.陰性對照；3～9.樣品。圖2 二陳合劑中甘草TLC圖

2.2 橙皮苷含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速為1.0 mL·min-1；流動相：甲醇-4%醋酸溶液(38∶62)；檢測波長為283 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱量橙皮苷對照品14.45 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得0.138 9 mg·mL-1對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液5 mL，置于10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到0.069 43 mg·mL-1對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液制備方法比較 1)精密吸取二陳合劑2 mL，置20 mL量瓶中，加入甲醇13 mL，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；2)精密吸取二陳合劑2 mL，置20 mL量瓶中，加入70%甲醇13 mL，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；3)精密吸取二陳合劑2 mL，置20 mL量瓶中，加入50%甲醇13 mL，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；4)精密吸取二陳合劑2 mL，置20 mL量瓶中，加入30%甲醇13 mL，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，用30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；5)精密吸取二陳合劑2 mL，置20 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

表1 供試品溶液不同制備方法測定結果 mg·mL-1

通過比較發現，甲醇和70%甲醇提取效率相當，50%甲醇、30%甲醇隨著甲醇濃度降低，測定結果逐漸降低。甲醇與70%甲醇相比，加入甲醇后樣品溶液有白色絮狀物析出，卷成一團，樣品分散不均勻，70%甲醇未發現該現象，所以最終選擇70%甲醇作為提取溶劑。然后比較了是否需要超聲，通過比較發現，未超聲的樣品含量明顯偏低，最終選擇提取方法為超聲提取。最后確立的供試品溶液制備方法為方法二。

2.2.2.3 制備陰性樣品溶液 按處方配比(除去橙皮)模擬制劑工藝，制備出缺少陳皮的陰性樣品，再按2.2.2.2項下方法二，制備陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性考察 采用自動進樣器依次吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀系統，按2.2.1項下色譜條件進行測定，結果見圖3，供試品溶液呈現與對照品溶液一致的橙皮苷色譜峰，陰性樣品溶液未出現橙皮苷的色譜峰，表明陰性對照無干擾，方法專屬性良好。經過與苯甲酸鈉對照品比對，發現橙皮苷附近的大峰為苯甲酸鈉防腐劑色譜峰。

注：A.橙皮苷對照品；B.二陳合劑樣品；C.缺陳皮陰性樣品；D.苯甲酸鈉對照品；1.橙皮苷；2.苯甲酸鈉。圖3 橙皮苷對照品、苯甲酸鈉對照品及二陳合劑樣品高效液相色譜圖

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取2.2.2.1項下0.069 43 mg·mL-1對照品溶液1、3、5、10 μL及0.138 9 mg·mL-1對照品儲備液10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積作為縱坐標(Y)，以對照品進樣量作為橫坐標(X)，制備標準曲線，得到線性回歸方程為：Y=1 660.8X+13.089(r=0.999 9)，結果橙皮苷進樣量在0.069 43～1.389 μg與其對應的峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.2.1項下0.069 43 mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液10 μL，連續進樣6針，計算出橙皮苷峰面積的RSD為0.14%，表明儀器進樣誤差小、儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批號(批號：170601)二陳合劑樣品6份，每份精密量取2 mL，置20 mL容量瓶中，加70%甲醇13 mL，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得重復性測定用供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件進樣測定，結果二陳合劑中橙皮苷平均質量濃度為0.457 mg·mL-1，RSD為0.50%，表明供試品溶液制備方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 采用加樣回收試驗，稱取已做重復性試驗的同批號二陳合劑樣品(批號：170601)6份，每份精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，每份分別加入橙皮苷對照品儲備液(0.138 9 mg·mL-1)3 mL，再加70%甲醇11 mL，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得回收率測定用供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率，結果二陳合劑中橙皮苷的平均回收率為101.10%，6份樣品的RSD為0.73%，表明方法回收率好，測定結果準確，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果(n=6)

2.2.8 穩定性試驗 精密吸取同一份二陳合劑供試品溶液，分別于0、4、11、19、27、32、40 h進樣，測定橙皮苷峰面積，計算各時間點橙皮苷峰面積的RSD為0.20%，表明二陳合劑供試品溶液中橙皮苷成分在40 h內穩定性良好。

2.2.9 樣品測定 對收集到的10批樣品，按上述色譜條件和方法測定二陳合劑中橙皮苷的含量，測定結果見表3。

表3 10批二陳合劑含量測定結果 mg·mL-1

3 討論

3.1 甘草薄層鑒別指標的選擇

《中華人民共和國藥典》中甘草的薄層鑒別方法是以甘草酸銨對照品及甘草對照藥材作為檢測指標，筆者通過實驗發現，甘草酸銨顯色不清晰，二陳合劑中其他成分對其干擾嚴重，所以未選擇甘草酸銨作為對照品。在選擇甘草對照藥材作為檢測指標時，其有4個亮黃色的黃酮斑點，但二陳合劑樣品中有個黃酮斑點與橙皮苷斑點剛好重合，缺味總是存在干擾。后改為以甘草苷對照品作為檢測指標，斑點對應良好，缺味無干擾，較好地解決了甘草的薄層鑒別難題。

3.2 橙皮苷含量測定結果討論及含量限度標準的建議

二陳合劑全國共有2家生產企業，本次實驗收集到浙江惠松制藥有限公司提供的7批樣品及太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司提供的3批樣品，根據10批樣品測定結果分析，太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司樣品含量較低，批間差異小；浙江惠松制藥有限公司樣品含量相對較高，但批間差異較大。推測可能原因是與處方工藝有較大關系，處方中陳皮提取工藝為“水煎煮3次，合并煎液，濾過”，橙皮苷在水溶液中溶解性較差，所以制劑中橙皮苷轉移率較低，橙皮苷較低的轉移率可能導致不同批次樣品之間測定結果差異大。根據10批樣品測定結果，建議暫擬訂限度為：本品每1 mL含陳皮以橙皮苷(C28H34O15)計，不得少于0.30 mg。由于本次實驗收集樣品批次較少，待以后測定更多批次數據，再制定合理的限度。

3.3 方中其他藥味薄層鑒別方法摸索

實驗過程中對方中其他藥味[半夏(姜制)、茯苓、生姜]的薄層鑒別方法進行過考察，半夏(姜制)、茯苓斑點較少且顯色不明顯，未能找到該兩味藥材的特征性斑點；生姜斑點較多，但是缺味始終存在干擾，故也未能建立生姜的專屬性鑒別方法。

3.4 橙皮苷對照品配置問題

實驗過程中發現，精密稱取橙皮苷對照品15 mg置100 mL量瓶中，加70%甲醇超聲溶解并定容至刻度，儲備液放置過程中，會析出橙皮苷固體結晶，影響后續儲備液的使用。通過摸索發現，儲備液用純甲醇配置，放置過程中不會析出橙皮苷結晶。