不同成熟度桑椹多酚綠原酸含量測定及抗氧化活性研究

韋麗文

柳州市中醫醫院，廣西 柳州 545001

桑椹為?？坡淙~喬木桑樹MorusalbaL.的果實，為聚花果，由多數小瘦果實集合而成，呈長圓形，長1～2 cm，直徑0.5～0.8 cm，黃棕色、紅棕色或暗紫色，具有滋陰補血、生津潤燥的功效，用于肝腎陰虛、心悸失眠、眩暈耳鳴、須發早白、內熱消渴、津傷口渴、腸燥便秘[1]。桑椹被普遍認為以成熟的紫黑色者為佳，《說文》中記載，“黑葚之黑也”；《中華本草》中記載桑椹分為黃棕色、紅棕色至暗紫色，但以肉厚、紫紅色、糖性大者為佳。而現今對桑椹的研究也多是對紫黑色成熟果實進行的，其藥用及營養價值得到普遍的認同，而對于未成熟的果實研究甚少。植物多酚是廣泛存在的一類物質，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降血糖血脂等功效，被廣泛應用于日常生活中[2-6]，桑椹中同樣富含多酚成分，綠原酸為桑椹多酚的重要組成成分，經測定比較，綠原酸在桑椹成熟過程中含量變化較大，本實驗以不同成熟度桑椹多酚為研究對象，探索其綠原酸含量與抗氧化活性在其成熟過程中的變化規律，分析其品質差別，擴寬桑椹資源的研究與利用。

1 材料

1.1 儀器

島津UV1800紫外可見分光光度計；超聲波清洗器(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；水浴鍋(HH-S，江蘇金壇市醫療儀器廠)；玻璃層析柱(10 mm×30 cm)；分液漏斗；移液槍(Eppendorf Research plus)。

1.2 試藥

AB-8大孔樹脂(天津市光復精細化工研究所)；鹽酸(愛廉化試劑有限公司)；氫氧化鈉(天津市博迪化工有限公司)；乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；石油醚(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；福林-酚試劑(上海荔達生物科技有限公司)；無水碳酸鈉(分析純，天津博迪化工股份有限公司)。

青、紅、黑3種不同成熟度桑椹藥材，采集于廣西南寧市蠶業技術推廣總站，樣品經廣西蠶業技術推廣總站朱方容研究員鑒定為?？粕僦参飶V東桑MorusatropurpureaRoxb.“桑特優二號” 的果穗。

2 桑椹多酚純化

2.1 桑椹多酚粗提物制備

取過120目篩的青、紅、黑桑椹粉末各2 g，精密稱定，共3份，分別置于100 mL具塞三角瓶中，加入50%的乙醇溶液適量，超聲提取20 min，離心取上清液，得到3種不同成熟度桑椹多酚粗提物。

2.2 桑椹多酚純化

取預處理好的AB-8大孔樹脂，精密稱定，濕法上柱，用純水沖洗至流出液透明。將3種不同成熟度的桑椹多酚粗提物分別控制流速為1.0 mL·min-1，進行動態吸附。將吸附后的AB-8大孔樹脂用少量純水沖洗，洗去可溶性雜質至流出液澄清，后用50%乙醇進行洗脫，洗脫速度為1.0 mL·min-1，合并洗脫液，得桑椹3種不同成熟度多酚純化物。

3 不同成熟度桑椹多酚綠原酸含量測定

3.1 藥材

按照2項下制備的桑椹多酚純化物。

3.2 試劑

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201205，供含量測定用)；乙腈(色譜純，Fisher Scientific)；甲醇(色譜純，Fisher Scientific)；冰醋酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水(美國Millipore密理博明澈TMD超純水系統)。

3.3 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機(G1322A)、高壓四元泵(G1311A)、標準自動進樣器(G1329A)、智能化柱溫箱(G1316A)、二極管陣列檢測器(G1315D)、Agilent Chemistation色譜工作站；高速冷凍離心機(TGL-20M，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司)；超聲波清洗儀(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多AE100電子分析天平)；美國Millipore密理博明澈TMD超純水系統；移液槍(Eppendorf Research plus)；水浴鍋(HH-S江蘇金壇市醫療儀器廠)；紫外可見分光光度計(日本島津)。

3.4 方法與結果

3.4.1 色譜條件 安捷倫Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%醋酸系統；流速為0.8 mL·min-1；檢測波長為327 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL。洗脫程序見表1。

表1 綠原酸含量測定洗脫條件

3.4.2 對照品溶液配制 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液制成質量濃度為0.11 mg·mL-1的綠原酸溶液，即得。

3.4.3 供試品溶液配制 青、紅、黑3種不同成熟度的桑椹多酚純化物適量，精密稱定，加50%甲醇溶液分別制成相應濃度的供試品溶液，離心，取上清液備用，得供試品溶液。

3.4.4 方法學考察

3.4.4.1 標準曲線繪制 取3.4.2的對照品溶液，分別稀釋為0、5、10、25、50、100倍，按3.4.1項下色譜條件進樣。以綠原酸峰面積為縱坐標，綠原酸濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為：Y=46 437X-15.21，r=0.999 9；表明綠原酸質量濃度在0.001 1～0.11 mg·mL-1線性關系良好

3.4.4.2 精密度試驗 取質量濃度為0.022 mg·mL-1的綠原酸對照品溶液，按按3.4.1項下色譜條件連續進樣6針，峰面積分別為913、912.1、910.1、904.3、902.9、903.5，RSD為0.25%，符合定量分析要求。

3.4.4.3 重復性試驗 按3.4.3項下供試品溶液制備方法，取青桑椹多酚純化物制備成1.0 mg·mL-1的溶液，平行制備6份，按3.4.1項下色譜條件進樣，計算綠原酸含量，RSD=1.84%，符合定量分析要求。

3.4.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液(青桑椹多酚溶液1.0 mg·mL-1)，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，按3.4.1項下色譜條件測定，RSD=1.26%，說明樣品在24 h內穩定。

3.4.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的青桑椹多酚純化物適量，精密稱定，配制成2.0 mg·mL-1的青桑椹多酚溶液，取0.5 mL該溶液，置于2.0 mL容量瓶，加入質量濃度為0.05 mg·mL-1的綠原酸對照品溶液0.5 mL，定容，平行6份，按3.4.1項下色譜條件進樣，計算綠原酸含量，測得平均回收率為97.7%，RSD為2.3%。結果見表2。

表2 綠原酸含量測定回收率考察結果(n=6)

3.4.4.6樣品測定 按3.4.3項下所述制備供試品溶液，青桑椹多酚溶液1.0 mg·mL-1，紅桑椹多酚溶液2.0 mg·mL-1，黑桑椹多酚溶液5.0 mg·mL-1，按3.4.1項下的色譜條件進樣，測綠原酸峰面積，根據回歸方程計算含量，綠原酸對照品及樣品HPLC圖見圖1～4。

圖1 綠原酸對照品HPLC圖

圖2 青桑椹多酚綠原酸HPLC圖

圖3 紅桑椹多酚純化物綠原酸HPLC圖

圖4 黑桑椹多酚純化物HPLC圖

3.4.4.7 樣品測定結果 由表3測定結果可知，青桑椹多酚中綠原酸質量分數為46.8 mg·g-1，紅桑椹多酚質量分數為29.5 mg·g-1，黑桑椹多酚質量分數為1.7 mg·g-1，由此可知，綠原酸含量排序為青桑椹多酚純化物>紅桑椹多酚純化物>黑桑椹多酚純化物。

表3 不同成熟度桑椹多酚中綠原酸的含量測定數據

4 不同成熟度桑椹多酚純化物抗氧化活性

4.1 材料

4.1.1 材料 按照2項下制得的青、紅、黑桑椹多酚純化物。

4.1.2 儀器 分析天平BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；移液槍(Eppendorf Research plus)；水浴鍋(HH-S，江蘇金壇市醫療儀器廠)；紫外可見分光光度計(日本島津)。

4.1.3 試劑 總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、VC對照品(南京建成生物工程研究院)；冰醋酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

4.2 總抗氧化能力(T-AOC)測試

4.2.1 原理 抗氧化物質能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質形成穩固的絡合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。

4.2.2 總抗氧化實驗與結果 取2項下制得的青、紅、黑桑椹多酚純化物適量，精密稱定，分別加2.0 mL純水進行溶解，將3種成熟度的桑椹多酚純化物配制成質量濃度為0.57 mg·mL-1的桑椹多酚溶液，將配制好的桑椹多酚純化物分別按1∶1、1∶5、1∶15、1∶25的比例稀釋，稀釋倍數分別為2、6、16、26，按照說明書的步驟方法做總抗氧化能力測試，每種稀釋濃度平行3份，并將Vc對照品也配制成0.57 mg·mL-1，作為陽性對照，計算總抗氧化能力。運用SPSS21.0，考察桑椹多酚稀釋倍數及成熟度雙因素對其總抗氧化能力的影響，將稀釋倍數2、6、16、26與成熟度青、黑、紅、Vc 4個水平進行雙因素考察，結果見表4～8，由表6可以看出不同稀釋倍數、成熟度以及稀釋倍數與成熟度的交互作用對桑椹多酚總抗氧化能力影響差異有統計學意義；由表7可以看出3種成熟度的桑椹多酚稀釋倍數越小，即桑椹多酚濃度越大，總抗氧化能力越強；而由表8可以看出不同成熟度總抗氧化能力大小為VC>青桑椹多酚>黑桑椹多酚>紅桑椹多酚。

表4 3種成熟度桑椹多酚純化物抗氧化能力測試結果

注：表中數值越大表明總抗氧化能力越強。

表5 3種成熟度不同稀釋倍數桑椹多酚純化物總抗氧化能力的描述統計

注：因變量為總抗氧化能力。

表6 3種成熟度不同稀釋倍數桑椹多酚純化物總抗氧化能力的主體間效應檢驗

表7 不同稀釋倍數桑椹多酚純化物總抗氧化能力的對比統計

注：數值越大，表示總抗氧化能力越強。

表8 3種成熟度桑椹多酚純化物總抗氧化能力對比統計

注：數值越大，表示總抗氧化能力越強。

5 討論

青、紅、黑3種成熟度桑椹多酚中均含有綠原酸，綠原酸質量分數分別為46.8、29.5、1.7 mg·g-1，由此可見，綠原酸含量在桑椹成熟過程中變化較大，桑椹成熟度越高，其綠原酸含量越低。

通過實驗對比發現，青、紅、黑3種成熟度桑椹多酚都有抗氧化活性。將同一成熟度的桑椹多酚抗氧化能力進行比較，總抗氧化能力隨著桑椹多酚濃度的增大而增強；而將不同成熟度桑椹多酚抗氧化能力進行比較發現，在一定濃度范圍內，3種成熟度的桑椹多酚的總抗氧化能力次序為青桑椹多酚>黑桑椹多酚>紅桑椹多酚，與綠原酸含量的變化并沒有直接聯系，這與桑椹多酚在成熟過程中成分變化有關，桑椹多酚中除了綠原酸外，還有如蘆丁、花青素等多種成分，同樣也具有抗氧化活性[7-8]，因此，桑椹多酚的抗氧化活性是多種成分共同作用的結果，而其中哪一種成分的抗氧化活性最強，且隨著桑椹成熟過程中，成分含量有著怎樣的變化還有待進一步研究。

通過實驗發現，除了大家所熟悉的黑桑椹中的多酚成分具有抗氧化活性外，青、紅桑椹多酚純化物的抗氧化活性不容小覷，這就意味著可以擴大桑椹資源的利用，人們食用的都是成熟的黑桑椹，沒有對未成熟的桑椹進行開發利用，那么，對于食品工業的保鮮劑、生態環境中的去污劑在醫藥行業中的應用，都可以對未成熟的桑椹多酚進行開發利用。