莢蒾屬植物DNA條形碼鑒定△

吳田澤，陳露，肖煜強，鄒問汀，胡心怡，李宇陽，劉霞*，黃升

1.武漢理工大學 化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070；2.湖北民族大學 林學園藝學院，湖北 恩施 445000；3.恩施冬升植物開發有限責任公司，湖北 恩施 445000

莢蒾屬ViburnumLinn.植物屬五福花科Adoxaceae灌木或小喬木，分布于我國各省，尤以西南部地區種類最多，具有相當長久的應用觀賞歷史。同時，莢蒾屬植物一直被作為民間藥用植物，具有悠久的藥用歷史。莢蒾屬植物始載于《新修本草》，具有清熱解毒、祛風除濕、健脾消食、抗衰老、強身、驅蟲等作用，臨床可用于治療小兒疳積、小兒發育不良、婦科疾病等[1-2]。目前，莢蒾屬很多物種未得到很好的開發和利用，其中活性成分的研究仍未完全明確。因此，建立一種快速、有效的鑒別方法將為其開發利用及活性成分的研究奠定重要基礎。

中藥材的傳統鑒別方法主要有基原鑒定、形態鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等，均具有不同程度的局限性。在中藥材鑒定中，DNA條形碼鑒定相比于傳統中藥鑒定方法有著革命性的進步[3-4]。DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認標準的、易擴增且相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術[5]，該DNA片段具有種間的多樣性及特異性，不受生物個體發育狀況及其形態特征所限制，可克服對經驗鑒定的過度依賴，實現自動化和標準化[6-7]。中藥材DNA條形碼分子鑒定是以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系，其中植物類中藥材選用ITS2為主體序列、psbA-trnH為輔助序列，主要適用于中藥材(包括藥材、藥材粉末以及部分藥材飲片)及基原物種的鑒定[1，4]，并且已在野菊[8]、霍山石斛[9]、羌活[10]、冬蟲夏草[11]、枸杞子[12]等中藥材上得到驗證。

本研究旨在通過DNA條形碼分子鑒定法對莢蒾屬類不同種類藥用植物進行鑒別研究，包括珊瑚樹、雞樹條、水紅木、煙管莢蒾等13種莢蒾屬藥用植物，建立該屬藥用植物鑒定的新方法，為其質量控制、合理開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 DNA條形碼鑒定材料

本研究通過野外考察等方式收集了莢蒾屬植物13種，共32份樣品，其中水紅木Viburnumcylindricum5份，川西莢蒾V.davidii2份，細梗紅莢蒾V.erubesens1份，珍珠莢蒾V.foetidumvar.ceanothoides1份，直角莢蒾V.foetidumvar.rectangulatum1份，珊瑚樹莢蒾V.odoratissimum2份，少花莢蒾V.oliganthum1份，雞樹條V.opulusvar.calvescens3份，蝴蝶戲珠花V.plicatumvar.tomentosum2份，球核莢蒾V.propinquum5份，皺葉莢蒾V.rhytidophyllum5份，臺東莢蒾V.taitoense2份，煙管莢蒾V.utile2份，分別來自湖北、四川、云南等地。所有樣品經中國科學院武漢植物園標本館原館長趙子恩研究員鑒定，樣品保存在武漢理工大學化學化工與生命科學學院中藥資源與分子鑒定實驗室。詳細樣品信息見表1。另從GenBank數據庫中下載上述13個物種ITS2序列共14條。見表2。

表1 采集的莢蒾屬植物樣品信息

表2 GenBank下載序列信息表

1.2 儀器與試劑

本實驗所用儀器見表3，所用試劑見表4。

表3 DNA條形碼研究所用儀器

表4 DNA條形碼研究所用試劑

2 方法

2.1 樣品處理及DNA提取

稱取樣品的干燥葉或果實20～30 mg，用高通量組織研磨器研磨120 s(50 Hz)，核分離液(2% PVP，20 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol·L-1NaCl)800 μL 抽提3次，56 ℃水浴過夜，然后用三氯甲烷-異戊醇(24∶1)800 μL抽提2次。利用植物基因組DNA提取試劑盒法(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA[13]，提取完成后，用50 μL ddH2O洗脫，4 ℃保存備用。

2.2 ITS2序列擴增和測序

以樣品DNA為模板，對ITS2序列進行擴增，引物、PCR反應條件及擴增程序均參考陳士林研究員課題組的研究[13-14]，詳細條件見表5。采用25 μL PCR反應體系：Premi X TaqTM酶12.5 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL，DNA模板2 μL。對擴增后產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在120 V電泳電壓下電泳20 min，利用DNA Marker判斷擴增產物的片段大小以及含量大小，并送至生工生物工程(上海)有限公司武漢分公司進行雙向測序。

表5 擴增引物及反應條件

2.3 數據處理

測序所得DNA序列峰圖，運用CodonCode Aligner V 6.0.2(Codon Code Co.，USA)軟件進行質量分析和拼接校對，采用基于隱馬爾科夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S rRNA和28S rRNA區段獲得完整的ITS2序列[15]。將所有DNA序列使用MEGA5.1處理軟件進行保守位點、變異位點等信息的分析比對，同時基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型計算遺傳距離并分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統聚類樹[16]，利用bootstrap(1000次重復)檢驗各分支的支持率。

3 結果與分析

3.1 種內變異分析

本研究中13種莢蒾屬藥用植物ITS2序列特征見表6。水紅木共6條序列，長度224～254 bp，48 bp處存在T-C變異，59 bp處存在A-T變異，239 bp處存在G-A變異，246 bp處存在T-C變異；平均GC質量分數為65.1%。川西莢蒾共3條序列，長度為223～253 bp，不存在種內變異位點；平均GC質量分數為65.8%。細梗紅莢蒾共2條序列，長度為219～225 bp，不存在種內變異位點；平均GC質量分數為61.0%。珍珠莢蒾共2條序列，長度為230～254 bp，不存在種內變異位點；平均GC質量分數為68.0%。直角莢蒾共2條序列，長度為224～230 bp，75 bp處存在C-G變異，173 bp處存在C-T變異；平均GC質量分數為67.6%。珊瑚樹莢蒾共3條序列，長度為219～225 bp，不存在種內變異位點；平均GC質量分數為61.0%。少花莢蒾共2條序列，長度為219～225 bp，不存在種內變異位點；平均GC質量分數為61.3%。雞樹條共4條序列，長度為220～251 bp，在85 bp處存在G-A變異；平均GC質量分數為67.2%。蝴蝶戲珠花共3條序列，長度為219～249 bp，75 bp處存在C-T變異，76 bp處存在A-G變異，106 bp處存在C-T變異；平均GC質量分數為59.9%。球核莢蒾共6條序列，長度為208～229 bp，152 bp處存在G-A變異，209 bp處存在G-A變異；平均GC質量分數為67.3%。皺葉莢蒾共6條序列，長度為219～249 bp，在71 bp處存在T-C變異；平均GC質量分數為66.5%。臺東莢蒾共3條序列，長度為208～249 bp，141 bp處存在C-T變異，167 bp處存在A-G變異，237 bp處存在C-T變異；平均GC質量分數為61.6%。煙管莢蒾共3條序列，長度為219～249 bp，在70 bp處存在T-C變異；平均GC質量分數為67.2%。

表6 樣品ITS2序列特征表

3.2 K2P遺傳距離分析

利用K2P模型計算遺傳距離，ITS2序列種內、種間平均遺傳距離見表7。結果顯示，水紅木種內最大遺傳距離為0.014 8，小于種間最小遺傳距離0.029 8；川西莢蒾種內遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.019 8；細梗紅莢蒾種內遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.009 8；珍珠莢蒾種內遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.014 8；直角莢蒾種內最大遺傳距離為0.009 8，小于種間最小遺傳距離0.014 8；珊瑚樹莢蒾種內遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.019 7；少花莢蒾種內遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.009 8；雞樹條種內最大遺傳距離為0.004 9，小于種間最小遺傳距離0.030 2；蝴蝶戲珠花種內最大遺傳距離為0.019 8，小于種間最小遺傳距離0.035 4；球核莢蒾種內最大遺傳距離為0.009 8，小于種間最小遺傳距離0.019 8；皺葉莢蒾種內最大遺傳距離0.004 9，小于種間最小遺傳距離0.014 7；臺東莢蒾種內最大遺傳距離為0.014 7，小于種間最小遺傳距離0.014 9；煙管莢蒾種內最大遺傳距離為0.004 9，小于種間最小遺傳距離0.014 7。13種莢蒾屬植物樣本種間遺傳距離均大于種內遺傳距離，表明ITS2序列作為條形碼基本可將莢蒾屬藥用植物從種水平上分開。各物種間遺傳距離為0.009 8～0.119 1，其中少花莢蒾與細梗紅莢蒾種間遺傳距離最近，臺東莢蒾和雞樹條種間遺傳距離最遠。

表7 13種莢蒾屬藥用植物種內和種間遺傳距離

3.3 系統進化樹(NJ樹)分析

基于ITS2序列對13種莢蒾屬藥用植物構建NJ系統聚類樹，利用bootstrap 1000次檢驗各分支置信度，各分支置信度均大于50%，見圖1。圖中水紅木以89%置信度聚為一支；雞樹條以99%置信度聚為一支；珍珠莢蒾以85%置信度聚為一支；直角莢蒾以55%置信度聚為一支；川西莢蒾以83%置信度聚為一支；球核莢蒾以94%置信度聚為一支；煙管莢蒾以90%置信度聚為一支；皺葉莢蒾以75%置信度聚為一支；蝴蝶戲珠花以95%置信度聚為一支；少花莢蒾以66%置信度聚為一支；細梗紅莢蒾以65%置信度聚為一支；珊瑚樹莢蒾以90%置信度聚為一支；臺東莢蒾以92%置信度聚為一支。每種莢蒾屬植物均呈現良好的單系性，可從NJ樹得到各個物種之間的進化和親緣關系。由此可見，利用ITS2序列作為條形碼可將莢蒾屬植物分開。

4 討論

莢蒾屬植物多為灌木或小喬木，花序為聚傘花序組成的復傘形花序或圓錐花序，小花繁多，白色，果實成熟時為紫紅色，具有極高觀賞價值。該屬植物在全世界約230多種，亞洲、南美洲種類較多。我國有74種，其中具有藥用價值的種類已達43種，其中以枝入藥的有11種，以根莖入藥的有11種，以根、莖、葉入藥的有4種，以根、果入藥的有8種，以根、莖、葉及花果入藥的有9種[16]。莢蒾屬植物藥用活性成分包括綠原酸、黃酮類、熊果酸、酚類、乙酰膽堿酶、β-谷甾醇等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗病毒、降低血脂和血糖等功能[2，17-20]。

4.1 ITS2序列鑒定方法

莢蒾屬植物物種類型多樣，由于其植物形態的相似性、遺傳關系的復雜性，因此鑒定莢蒾屬植物是一個難題。劉震等[21]對忍冬科藥用植物DNA條形碼通用序列的篩選實驗中，利用ITS2序列成功完全區分開6個莢蒾屬近緣種，為本實驗莢蒾屬物種鑒別提供了一定指導依據。

在本實驗中，13種莢蒾屬植物提取到高質量ITS2序列的成功率為100%，ITS2序列的種內變異均較小，具有良好的穩定性。13種莢蒾屬植物ITS2序列種內最大遺傳距離均小于種間最小遺傳距離；將所有樣品的ITS2序列基于以鄰接法、最大簡約法、最大似然法估計構建NJ樹的結果表明，各種莢蒾屬植物均獨自聚為一支，表現出良好的單系性。證實ITS2條形碼序列能準確鑒別莢蒾屬藥用植物。綜上所述，ITS2序列可用于莢蒾屬藥用植物的鑒定，是基于分子條形碼技術鑒定的理想序列。

注：Bootstrap 1000次重復，支上數值僅顯示自展支持率≥50%。圖1 樣品ITS2序列構建的13種莢蒾屬植物的NJ系統聚類樹

4.2 研究展望

本實驗主要研究了我國分布在四川、湖北等地的川西莢蒾、皺葉莢蒾、珊瑚樹莢蒾等品種，還有許多莢蒾屬其他品種沒有進行全面采集研究，需要進一步擴大樣品量來驗證鑒定體系的精密性與有效性。

本研究通過ITS2序列鑒定，可以確切鑒定物種是否為莢蒾屬植物，并且可以初步確定被測樣品物種，為后續的莢蒾屬鑒定體系鑒定發展打下了堅實的基礎。在后續的研究中，可以在本研究采用的ITS2序列的基礎上，使用psbA-trnH、rbcL、matK等其他DNA條形碼序列進行延伸研究和輔助驗證。從而構建更加準確、快速的莢蒾屬植物DNA條形碼鑒定體系，并輔以傳統的鑒定方法，為莢蒾屬植物鑒定提供有力的方法。

5 總結

本研究通過莢蒾屬植物樣品DNA提取、ITS2序列和psbA-trnH序列擴增、DNA條形碼測序以及系統進化樹分析，確定了莢蒾屬植物種間鑒定體系，不僅可以初步進行莢蒾屬植物鑒定，為日后更加準確、快速地鑒定莢蒾屬植物打下堅實的基礎，從而更好地進行莢蒾屬植物的開發與利用研究。