白藜蘆醇通過(guò)激活PI3K/Akt通路抑制高糖致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的研究△

楊莎莎，周利

湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬太和醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 十堰 442000

糖尿病腎病(DN)的特征在于腎炎、尿白蛋白、腎小球?yàn)V過(guò)率降低、腎小球硬化癥和腎間質(zhì)纖維化，是終末期腎病(ESRD)的主要原因。因此，探索介導(dǎo)DN的機(jī)制對(duì)于緩解DN的預(yù)防和治療策略至關(guān)重要[1]。白藜蘆醇(RSV)是一種天然多酚化合物，存在于各種水果中，如葡萄、堅(jiān)果、漿果以及紅葡萄酒。以前的研究表明，RSV具有多種有益的健康效果，包括抗氧化、抗炎、抗癌、心臟保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)活動(dòng)。關(guān)于糖尿病腎病，以前的報(bào)道表明RSV可以改善腎功能不全和病理改變，以及通過(guò)體內(nèi)糖尿病條件下的多種信號(hào)通路阻止高葡萄糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖和腎小球纖維連接蛋白的表達(dá)[2]。現(xiàn)已有研究報(bào)道指出，白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，從而對(duì)糖尿病腎病起保護(hù)作用[3-4]。

糖尿病患者的死亡率很高。由高血糖引起的線粒體功能障礙有助于DN發(fā)生發(fā)展，其原理可能與活性氧(ROS)過(guò)度產(chǎn)生和腺苷三磷酸(ATP)產(chǎn)生的降低有關(guān)，尤其是在腎小管上皮細(xì)胞。近端腎小管主要作用水的重吸收、葡萄糖及電解質(zhì)(鈉離子)運(yùn)輸，這些都需要大量的ATP。而ATP主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)的線粒體。當(dāng)細(xì)胞受到損害(氧化應(yīng)激)，線粒體功能障礙導(dǎo)致ATP產(chǎn)出減少。因此，腎氧化應(yīng)激是DN重要的發(fā)病機(jī)制之一，抑制腎氧化應(yīng)激可有效地治療DN，這為其治療提供了新切入點(diǎn)[5]。

磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶(PI3K)蛋白激酶B(Akt)途徑即PI3K/Akt，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老、抗氧化的關(guān)鍵信號(hào)通路[6]。研究表明，PI3K/Akt通路對(duì)氧化應(yīng)激及其引起的凋亡起著重要的保護(hù)作用[7]。大量研究報(bào)道指出，白藜蘆醇具有抗氧化應(yīng)激的作用[8]。基于上述報(bào)道，本研究采用高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷作為模型，探討白藜蘆醇是否通過(guò)激活PI3K/Akt通路抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而對(duì)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

白藜蘆醇(南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JS190524，純度：99%)。腎小管上皮細(xì)胞(HK-2,南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

胎牛血清(美國(guó)Earthox公司)、胰酶和DMEM培養(yǎng)基(上海翊圣生物科技公司)；MTT試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；JC-1(線粒體膜電位)試劑盒購(gòu)自AAT Bioquest；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(Annexin-V/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司)；二氫乙錠(DHE，美國(guó)AAT Bioquest公司)；抗體磷酸化Akt(p-Akt)、Akt、細(xì)胞色素C(CYT-C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司；LY294002(美國(guó)APExBIO公司)。

1.2 儀器

立式壓力蒸氣滅菌器(上海三中醫(yī)療器械有限公司)，干燥箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)有限公司)，二氧化碳孵箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)，熒光顯微鏡(德國(guó) Leica公司)，高速臺(tái)式大容量離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司)，多頭磁力攪拌器(江蘇中大儀器廠)，超聲波破碎機(jī)(美國(guó)SONICS公司)，制冰機(jī)(日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)，優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(新加坡優(yōu)普公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACSCelestaTM公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到90%左右的融合度時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組(平行孔數(shù)n=5)：空白對(duì)照組；模型組(培養(yǎng)基中加入30 mmol·L-1高糖孵育8 h)；白藜蘆醇低、高濃度組(培養(yǎng)基中分別先加入5、10 μmol·L-1白藜蘆醇孵育4 h，再加入30 mmol·L-1高糖孵育8 h)；PI3K抑制劑組(10 μmol·L-1白藜蘆醇和10 μmol·L-1PI3K抑制劑LY294002共同處理4 h，再加入30 mmol·L-1高糖孵育8 h)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中。按本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組及給藥方法培養(yǎng)后，去上清液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液90 μL、MTT 10 μL(5 g·L-1)，培養(yǎng)4 h；然后棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，搖床中振搖15 min后，在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。根據(jù)每組細(xì)胞的吸光度(A)值計(jì)算細(xì)胞活力。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理各細(xì)胞組后，消化、離心、收集細(xì)胞。用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/L。按照Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，在每組細(xì)胞中加入5 μL的Annexin-V及10 μL的PI，反應(yīng)15 min，加入300 μL緩沖液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。Q1：壞死細(xì)胞比例；Q2：晚期細(xì)胞凋亡比例；Q3：正常細(xì)胞比例；Q4：早期細(xì)胞凋亡比例。其中總凋亡率=Q2+Q4。

2.4 DHE熒光探針檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞中ROS的變化

根據(jù)文獻(xiàn)中的方法[9]，將腎小管上皮細(xì)胞以1×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中。分組、給藥同上，24 h后棄去上清液，PBS洗3次，加入10 μmol·L-1的DHE，37 ℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。使用Imge-pro plus 6軟件分析，結(jié)果以熒光強(qiáng)度表示。

2.5 JC-1檢測(cè)線粒體跨膜電位(MMP)

將腎小管上皮細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)分5組：空白對(duì)照組、模型組、白藜蘆醇組(濃度為5、10 μmol·L-1)、PI3K抑制劑組。細(xì)胞培養(yǎng)和處理方法同2.1，培養(yǎng)結(jié)束后，加入1 mL的JC-1染色工作液(5 mg·L-1)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37 ℃溫育20 min，然后用JC-1染色緩沖液洗滌兩次，同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)液。利用倒置熒光顯微鏡觀察熒光，測(cè)量紅色和綠色熒光強(qiáng)度以了解細(xì)胞線粒體膜電位(ΔΨM)的變化。正常線粒體顯示紅色熒光，當(dāng)ΔΨM降低時(shí)，顯示綠色熒光。使用Imge-pro plus 6.0軟件分析。聚集體和單體JC-1的比例用于量化線粒體膜電位的變化。

2.6 腎小管上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)測(cè)定

收集各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)LDH、MDA、SOD、GSH-PX含量變化。

2.7 免疫印跡法(Western-blot)測(cè)定蛋白表達(dá)

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞后，棄去上清液，收集各組細(xì)胞置于裂解液(RIPA+1 mmol·L-1PMSF)中(4 ℃)。各組的樣本蛋白濃度通過(guò)BCA蛋白定量測(cè)定腎小管上皮細(xì)胞中的蛋白濃度。添加5×的上樣緩沖液，在沸水中放置4 min。40 μg蛋白在8%～12% SDS-PAGE中，85 V的條件下2 h，然后通過(guò)半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜15 V、20 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜在1%BSA中室溫封閉2 h。添加一抗p-Akt、Akt、CYT-C、Caspase-3一抗(1∶1000)，4 ℃過(guò)夜。TBST清洗3次，每次5 min。PVDF膜在室溫下孵育二抗2 h。TBST清洗3次，每次5 min。通過(guò)ECL顯影液進(jìn)行顯影。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞活力的影響

MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，高糖損傷組活力顯著降低(P<0.01)，而白藜蘆醇組細(xì)胞活力明顯上升(P<0.01)。LY294002組結(jié)果與白藜蘆醇高濃度組相反(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明白藜蘆醇可以增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞的活力，而LY294002能阻止這種效果(見(jiàn)表1)。

表1 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活力的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與白藜蘆醇高濃度組比較，##P<0.01，下同。

3.2 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖損傷組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01，與對(duì)照組比較)；而不同濃度的白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.01)；PI3K抑制劑組結(jié)果與白藜蘆醇高濃度組相反(P<0.01)；說(shuō)明白藜蘆醇能減少高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率，而LY294002能阻止這種效果(見(jiàn)圖1、表2)。

圖1 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的影響

表2 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

3.3 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞ROS的影響

DHE熒光探針檢測(cè)顯示，高糖損傷組腎小管上皮細(xì)胞ROS顯著升高(P<0.01)，而白藜蘆醇組ROS含量則明顯降低(P<0.01)，PI3K抑制劑組結(jié)果與白藜蘆醇高濃度組相反(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇可以在高糖作用后減少腎小管上皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，而LY294002可以阻止這種作用(見(jiàn)圖2，表3)。

圖2 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞的ROS影響

表3 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞ROS的影響

3.4 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的影響

JC-1檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位的變化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組(高糖損傷組)腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降(P<0.01)；而不同濃度白藜蘆醇組細(xì)胞線粒體膜電位隨濃度梯度逐漸上升(P<0.01)；PI3K抑制劑組與白藜蘆醇組結(jié)果相反(P<0.01)(見(jiàn)圖3、表4)。

表4 白藜蘆醇對(duì)腎小管上皮細(xì)胞膜電位(MMP)的影響

3.5 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖損傷組LDH、MDA含量顯著增加，SOD、GSH-PX活性顯著下降(與對(duì)照組相比，P<0.01)；白藜蘆醇具有改善細(xì)胞抗氧化能力，各組LDH、MDA含量逐漸下降，SOD、GSH-PX活性逐漸上升(P<0.01)。PI3K抑制劑組結(jié)果與高濃度白藜蘆醇組相反(P<0.01)(見(jiàn)表5)。

圖3 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響

分組劑量/μmol·L-1LDH/U·L-1MDA/nmol·mg-1SOD/U·mg-1GSH-PX/U·mg-1空白對(duì)照組252.8±44.7??2.13±0.23??38.1±2.2??146.1±16.3??高糖損傷組(模型組)30974.5±129.14.49±0.2814.3±1.462.5±12.9白藜蘆醇低濃度組5727.6±164.4?3.65±0.34?22.7±3.5?85.4±13.4?白藜蘆醇高濃度組10478.2±175.8??2.66±0.17??34.5±4.1??116.7±18.2??PI3K抑制劑組10+10955.3±156.9##4.37±0.25##15.2±1.7##61.2±10.7##

3.6 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞CYT-C、Caspase-3、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)的影響

Western-blot分析顯示，模型組腎小管上皮細(xì)胞中p-Akt/Akt的表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)。白藜蘆醇恢復(fù)了細(xì)胞p-Akt/Akt的表達(dá)(P<0.01)，抑制劑發(fā)揮效應(yīng)，阻止這種作用。模型組中CYT-C、Caspase-3的表達(dá)升高，白藜蘆醇可以降低CYT-C、Caspase-3的表達(dá)(P<0.01)，PI3K抑制劑組結(jié)果與之相反。提示白藜蘆醇可能通過(guò)上調(diào)p-Akt/Akt的表達(dá)來(lái)降低CYT-C、Caspase-3的表達(dá)，而LY294002可以阻止這種作用。因此，白藜蘆醇抑制氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制與PI3K/Akt通路密切相關(guān)(見(jiàn)圖4、表6)。

注：A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.白藜蘆醇低濃度組；D.白藜蘆醇高濃度組；E.PI3K抑制劑組。圖4 白藜蘆醇對(duì)高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞中CYT-C、Caspase-3、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)的影響

4 討論

糖尿病已成為全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。在中國(guó)，糖尿病在成年人中的患病率達(dá)到了10.9%。DN是糖尿病的常見(jiàn)慢性微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的重要原因。同時(shí)，糖尿病患者大約40%有DN。腎小球結(jié)構(gòu)肥大、腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生、腎小管間質(zhì)擴(kuò)張以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分(如膠原和纖維連接蛋白)的異常積聚是DN的主要病理特征。膠原纖維的增加是腎纖維化的主要特征。在此過(guò)程中，腎臟經(jīng)歷過(guò)多的膠原沉積，導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)逐漸硬化和瘢痕形成，最終導(dǎo)致腎功能完全喪失[10]。本研究在體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)用高糖刺激能明顯增加腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病腎病共同的發(fā)病途徑[11]。

糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中，活性氧扮演著重要角色[12]。有報(bào)道指出，氧化應(yīng)激引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，活性氧在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。在高糖環(huán)境下ROS產(chǎn)生過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致核酸斷裂、酶失活、多糖解聚、脂質(zhì)過(guò)氧化和許多其他破壞性過(guò)程，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇降低了高糖作用后腎小管上皮細(xì)胞ROS含量。LDH、MDA、SOD、GSH-PX代表著細(xì)胞的氧化應(yīng)激的水平。本實(shí)驗(yàn)中，模型組LDH和MDA升高，而不同濃度的白藜蘆醇組LDH和MDA含量逐漸下降，證明白藜蘆醇可以減少細(xì)胞氧化應(yīng)激。

PI3K/Akt途徑是細(xì)胞周期過(guò)程中非常重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。它與細(xì)胞靜止、增殖、癌癥和長(zhǎng)壽等有關(guān)[14]。PI3K活化磷酸化并進(jìn)一步激活A(yù)kt，Akt定位于細(xì)胞膜。活化的Akt具有多種生物學(xué)功能，包括激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，抑制p27，在細(xì)胞質(zhì)中定位叉頭盒蛋白O(FOXO)，激活磷脂酰肌醇3-磷酸(PtdIns3ps或PI3P)和激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。已經(jīng)確定PI3K/Akt途徑可以通過(guò)幾種生物分子增強(qiáng)，包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1和胰島素鈣調(diào)蛋白。相反，該途徑被其他分子拮抗，包括PTEN、糖原合成酶激酶3β和轉(zhuǎn)錄因子HB9。PI3Ks是脂質(zhì)激酶家族，通過(guò)磷脂酰肌醇(PI)的特異性催化3-羥基磷酸化產(chǎn)生第二信使[15]。PI3K/Akt信號(hào)途徑的磷酸化作用生成p-Akt而被激活，抵抗細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[16]。在我們的研究中，白藜蘆醇激活PI3K/Akt通路，這是抑制氧化應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。

分組劑量/μmol·L-1p-Akt/AktCYT-C/β-actinCaspase-3/β-actin空白對(duì)照組1.19±0.21??0.26±0.12??0.35±0.12??高糖損傷組(模型組)300.23±0.101.16±0.171.29±0.21白藜蘆醇低濃度組50.49±0.16?0.73±0.13?0.82±0.15?白藜蘆醇高濃度組101.02±0.18??0.41±0.11??0.47±0.13??PI3K抑制劑組10+100.25±0.09##0.99±0.14##1.26±0.17##

綜上所述，白藜蘆醇部分可能通過(guò)激活PI3K/Akt通路抑制了高糖介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷及凋亡。