大鼠酒精性肝纖維化模型的建立

潘婷 宰青青 王翠肖

【摘要】目的：建立大鼠酒精性肝纖維化模型，觀察造模過程中大鼠肝組織的變化及建模的可行性。方法：取40只Wistar雄性大鼠，隨機分為造模組（n=30）和正常對造組（n=10）。造模組予“60%乙醇-吡唑-玉油”混合液灌胃（1次/天）制備酒精性肝纖維化大鼠模型，正常對照組予等量生理鹽水灌胃。于造模12、16、24周末分批心臟采血，以測定肝功能指標，后行放血法處死。取出肝組織先稱重再行HE染色法觀察肝組織的病理變化。結果：與正常對照組比較，造模組大鼠肝指數、血清ALT和AST明顯升高，差異具有統計學意義。在造模12周末呈現輕度酒精性肝纖維化，隨著造模時間的延長肝纖維化逐步加重，但并未呈現肝硬化的表現。結論：應用“60%乙醇-吡唑-玉米油”混合液灌胃法可成功建立大鼠酒精性肝纖維化模型。

【中圖分類號】R249【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2019）06-035-01

酒精性肝纖維化（Alcoholic liver fibrosis，ALF）是因為在乙醇、乙醛的慢性持續性損傷作用下，肝臟纖維組織大量增生，而基質金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑調節失衡，最終導致細胞外基質大量沉積的結果[1]，隨著我國經濟水平的提高以及飲酒文化的影響，引發的ALF患病率越來越多。而ALF是病情逆轉的關鍵點[2-3]，它可阻斷病情向肝硬化的發展。目前研究酒精性肝纖維動化動物模型比較多，但想要迅速建立一個簡便、經濟實惠、穩定性強、周期短、成功率高的模型比較困難，本文在前人研究的基礎上[4-6]，對造模方法稍加改進，擬在探討60%乙醇-吡唑-玉米油聯合造模的可行性。

1 材料

1.1 儀器

ELX800-MV型酶標儀（美國Bio-Tek公司）;AO-820手動石蠟切片機（英國制造）;IX71型倒置顯微鏡（日本Olympms 公司）。

1.2 藥品與試劑

無水乙醇（重慶川東化工集團有限公司，批號：20160201）;丙氨酸轉氨酶（ALT）測定試劑盒（南京生物建成有限公司，批號： 20160911）;天冬氨酸轉氨酶（AST）測定試劑盒（南京生物建成有限公司，批號：20161011）;玉米油（山東魯花集團有限公司）;吡唑（上海阿爾丁生化科技股份有限公司）

1.3 動物

健康Wistar雄性大鼠40只，體重為180～220g，SPF級（遼寧長生生物科技有限公司提供，許可證號SCXK（遼）2015-0001。

2 方法

按照文獻中的方法[4-6]并加以改進。將40只雄性Wistar大鼠正常喂養1周后隨機分為造模組（n=30）和正常對照組（n=10），造模組每日予60%乙醇、玉米油、吡唑按質量比1000：250：3混合成混懸液灌胃，第1周灌胃劑量6mL/kg/d，，第2周灌胃劑量8mL/kg/d，第3周灌胃劑量10mL/kg/d，第四周灌胃劑量12mL/kg/d，以后維持此量直至24周末。同時正常對照組予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠正常飲食。在造模12、16、24周末分批禁食、禁飲12h，稱定大鼠體重。用10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉固定后，心臟取血，抽取5～10mL血液，于室溫環境下擱置30分鐘，離心（3000rpm，15min）取上層血清，待測血清肝功能指標。取出肝組織，精確稱取肝總量并計算肝指數。取一部分肝組織用10%中性福爾馬林固定。

2.1 檢測血清肝功能指標按照試劑盒說明書操作，采用微板法測定血清中ALT和AST的含量。

2.2 計算肝指數肝指數=肝質量（mg）/體質量（g）×100%

2.3 組織病理學指標檢測各組大鼠肝組織在10%中性福爾馬林固定24h后，經脫水、石蠟包埋、切片后，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。于電子顯微鏡下觀察肝臟病理學變化。

2.4 統計方法采用SPSS17.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清ALT和AST的活性與正常對照組比較，各造模組ALT 和AST明顯升高（P<0.01），隨著酒精刺激時間的延長，ALT和AST升高更加顯著。見表1.

3.2 大鼠肝指數的測定結果與正常對照組比較，各造模組大鼠體重顯著下降（p<0.05或p<0.01），肝指數明顯升高（p<0.05或p<0.01）。結果見表2

3.3 肝組織病理學觀察

各組大鼠行HE染色鏡下可見：正常對照組見肝細胞排列整齊，細胞核大而圓，有1個至數個核仁，多核細胞多見，肝板以中央靜脈為中心呈放射狀分布。造模12周見肝細胞脂肪變性，大量炎細胞浸潤，可見竇周有少量纖維組織沉積。造模16周肝細胞脂肪變性加重，有大量脂滴溢出，肝細胞壞死和炎細胞浸潤明顯，匯管區有大量纖維組織沉積。造模24周肝細胞壞死、炎細胞浸潤更加嚴重，中央靜脈、匯管區及其匯管周圍有大量纖維組織沉積，部分肝小葉被破壞但未出現酒精性肝硬化的表現。

4 討論

目前關于酒精性肝纖維化造模的方式有很多，如Liber-Decarli液體食料模型[7]和Liber-Decarli液體食料加輔劑模型[8]等模型，但由于大鼠天生厭酒，加之實驗周期長，費用高、成功率比較低，已經很少采用。目前比較常用的是酒精-吡唑-玉米油混合液灌胃法復制酒精性肝纖維化模型，該模型操作簡單、周期短，成模率高。本次實驗中，造模大鼠12周出現了輕度的酒精性肝纖維化，而且隨著造模時間的延長，肝纖維程度逐漸加重，至造模24周匯管區及匯管周圍出現大量纖維組織沉積，許多肝小葉結構被破壞，但并導致酒精性肝硬化的表現。采用酒精-吡唑-玉米油混合液灌胃法可成功制備酒精酒精性肝纖維化模型。

參考文獻：

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[5]楊瑩帆，鄭希元，趙欣等。丹參粉針劑對酒精致大鼠慢性肝纖維化的保護作用[J].中國新藥雜志，2014，23（21）：2556-2559.

[6]陳宏輝，張明亮，陽學風，等，骨調素對巨噬細胞在酒精性肝纖維化肝組織局部浸潤的影響[J].肝臟，2004，9（4）：244-246.

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[8]YOKOYAMA H，NAGATA S，MORIYA S，etal.Hepatic fibrosis produced in guinea pigs by chronic ethanol administration and immunization withacet adehyde adducts[J].Hepatology，1995，21：1438-1442.