姜黃素對KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt信號通路的影響

舒子震 吳向陽(通訊作者)

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南 長沙 410000）

（2湖南省第二人民醫(yī)院 湖南 長沙 410000）

1.材料與方法

1.1 動物分組及造模

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行編號并稱重，將30只SD大鼠隨機(jī)分為對空白組、模型組、對照組，每組10只。除空白組外，其余2組均采用改良Hulth法造模[1]，離斷內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板1/3，避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面。術(shù)后第2天開始驅(qū)趕動物，30min/d，連續(xù)4周。姜黃素溶于10%的DMSO溶液制備成5%的溶液，術(shù)后4周開始，治療組予以每天100mg/kg姜黃素灌胃，模型組予以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

1.2 大體形態(tài)觀察評定

過量水合氯醛處死各組大鼠，碘伏消毒左后肢，暴露整個(gè)膝關(guān)節(jié)腔，觀察各組模型動物左側(cè)膝關(guān)節(jié)情況，參照Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)予以形態(tài)學(xué)評分，見表1。

1.3 組織病理性檢測

將各組OA模型大鼠股骨髁標(biāo)本切片進(jìn)行HE染色及甲苯胺藍(lán)染色，于光鏡下觀察軟骨面是否平整，有無裂隙，細(xì)胞是否規(guī)則分布、排列，潮線是否完整；軟骨及基質(zhì)甲苯胺藍(lán)失染程度，參照Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評分，見表1。

表1 病理Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 ELISA檢測

精密天平稱取軟骨組織，以1g:10mL加入磷酸鹽緩沖液（PBS），冰上迅速研磨粉碎，充分震蕩后12000 r/min離心，取上清液備用。根據(jù)大鼠β-連環(huán)蛋白(β-catenin)酶聯(lián)免疫分析(ELISA) 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 Mankin’s評分結(jié)果

2.1.1 大體標(biāo)本評分結(jié)果 觀察各組SD大鼠左膝關(guān)節(jié)。空白組關(guān)節(jié)腔內(nèi)均未見明顯積液，滑膜無水腫及充血，軟骨表面光滑平整基本無裂隙，軟骨透明呈藍(lán)白色；模型組中均伴有明顯關(guān)節(jié)腔積液，滑膜組織可見明顯充血水腫，軟骨呈灰黃色，無明顯光澤感，表面較粗糙，并可見出血糜爛；治療組中，關(guān)節(jié)腔積液較模型組少，滑膜組織可見充血水腫，部分標(biāo)本軟骨面相對不平整，光澤暗淡，顏色稍黃，少見出血及糜爛。

大體形態(tài)比較：將空白組與模型組，模型組與經(jīng)姜黃素灌胃治療4周后的治療組大鼠參照Mankin’s評分進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較，結(jié)果有顯著性差異（P＜0.05），見表2。

2.1.2 光鏡下評分結(jié)果 在光鏡下分別觀察3組標(biāo)本病理切片，空白組鏡下可見基質(zhì)均勻著色，軟骨細(xì)胞圓潤，排列整齊，軟骨層較厚，潮線完整，甲苯胺藍(lán)染色基質(zhì)染色均勻；模型組中，軟骨基質(zhì)著色明顯變淡，細(xì)胞體積及細(xì)胞核增大，形態(tài)不規(guī)則，多見簇集細(xì)胞團(tuán)，軟骨層厚度顯著變薄，可見有裂隙，甚至軟骨存在部分軟骨缺損，部分出現(xiàn)鈣化層；潮線完整性較空白組顯著紊亂，部分可見血管入侵；甲苯胺藍(lán)染色基質(zhì)失染嚴(yán)重。治療組標(biāo)本切片鏡下表現(xiàn)介于空白組與模型組之間，少見簇集細(xì)胞團(tuán)，軟骨層厚度較正常組變薄，潮線紊亂。

軟骨細(xì)胞、潮線完整性、甲苯胺藍(lán)染色比較：空白組與模型組、治療組與模型組進(jìn)行比較，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組標(biāo)本Mankin’s評分結(jié)果（，分）

表2 各組標(biāo)本Mankin’s評分結(jié)果（，分）

組別 例數(shù) 大體 HE軟骨 HE潮線 甲苯胺藍(lán)空白組 10 0 0 0 0.1±0.32模型組 10 3.2±0.92 2.4±0.52 1.6±0.52 2.7±0.67治療組 10 1.7±0.82 1.3±0.48 1.1±0.32 1.2±0.42

2.2 ELIASA檢測結(jié)果

空白組軟骨組織?-catenin蛋白含量顯著低于模型組及治療組（P＜0.05），模型組軟骨組織中?-catenin蛋白含量顯著高于治療組（P＜0.05），見表3。

表3 各組標(biāo)本軟骨組織中?-catenin蛋白含量（）

表3 各組標(biāo)本軟骨組織中?-catenin蛋白含量（）

組別 空白組 模型組 治療組例數(shù) 10 10 10含量 2.41±0.83 10.49±0.53 5.01±0.75

3.討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，目前認(rèn)為，OA是在生物力學(xué)因素的作用下，破壞了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)以及軟骨下骨的降解和修復(fù)的動態(tài)平衡的結(jié)果[1]。現(xiàn)已知多種細(xì)胞類型、細(xì)胞因子、信號通路等參與到了疾病過程中。實(shí)驗(yàn)采用改良Hulth法以改變相應(yīng)關(guān)節(jié)的正常力線來建立動物模型，符合KOA發(fā)病的自然規(guī)律，更加貼合臨床實(shí)際[2-4]。本實(shí)驗(yàn)中空白組模型動物膝關(guān)節(jié)標(biāo)本及切片評分遠(yuǎn)低于模型組，形態(tài)學(xué)及病理學(xué)觀察模型組動物膝關(guān)節(jié)軟骨改變符合KOA病理改變[5]。模型組與治療組實(shí)驗(yàn)動物的關(guān)節(jié)軟骨均不平整，其中治療組評分明顯優(yōu)于模型組；光鏡下可見治療組細(xì)胞核無明顯增大表現(xiàn)，形態(tài)較模型組規(guī)則，少見簇集細(xì)胞團(tuán)，基質(zhì)輕度失染，各項(xiàng)評分均低于模型組。表明治療組SD大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度相較模型組明顯減輕，這一結(jié)果與宋永周[6]等人以及陳瓊[7]等人進(jìn)行的體外軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相符合，提示姜黃素通過保護(hù)KOA大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨而治療OA。β-catenin作為Wnt信號通路中的一個(gè)重要組成部分，是整個(gè)經(jīng)典信號通路的關(guān)鍵[8-9]。越來越多的研究表明β-catenin的含量在退變的軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并由此激活Wnt信號通路參與到軟骨的損傷過程中。姜黃素是一種具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用的植物多酚[10]。可直接作用于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白及基因，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號通路中的各類蛋白或細(xì)胞因子而發(fā)揮其強(qiáng)大的藥理作用。宋魏[11]和張宋歐[12]等研究表明姜黃素可通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路參發(fā)揮抗腫瘤、抗炎等作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本中的β-catenin蛋白含量明顯高于空白組及治療組，表明KOA關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin蛋白表達(dá)水平上調(diào)，姜黃素可通過下調(diào)其表達(dá)水平而保護(hù)關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨。治療組中光鏡下可見軟骨基質(zhì)丟失較模型組少，考慮姜黃素可能通過下調(diào)β-catenin蛋白表達(dá)，減少基質(zhì)降解而發(fā)揮其保護(hù)作用。