奶粉中阪崎克羅諾桿菌耐干燥性與MLST分型的研究

高建欣，杜欣軍，李萍，王碩

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.南開大學醫學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津 300071）

阪崎克羅諾桿菌是一種條件性食源致病菌，其感染已經被認為是最常見的危及生命的病例，可以導致嬰兒腦膜炎、敗血癥、壞死性小腸結腸炎和系統性膿毒疾等疾病[1]。很多報道指出，嬰兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）是阪崎克羅諾桿菌的主要來源和載體[2-3]。因此，許多國家對于PIF 中這種病原體的監測越來越重視。在PIF 生產過程中，前期的巴氏消毒法能夠滅活所有的阪崎克羅諾桿菌，但加入的配料不能用于巴氏消毒，加入被污染的配料可能導致該菌在成品奶粉中出現，另外加工設備不經滅菌處理，也可能是導致嬰兒配方奶粉污染的重要原因[4]。在2010年和2012年，Li 等[5]對中國陜西省12 個城市的705 種零售牛奶嬰幼兒食品樣品中的阪崎克羅諾桿菌流行情況進行了調查，其中19 種樣品阪崎腸桿菌為陽性，感染率為16.9%。這為阪崎克羅諾桿菌廣泛的發病率提供了新的流行病學證據，說明消費者存在非常大的潛在健康風險。阪崎克羅諾桿主要導致早產兒或嬰幼兒患病[6]，對其他年齡階段的人也有致病性，特別是免疫力低下的成年人或老人[7]。但阪崎克羅諾桿菌是如何開始感染宿主細胞的目前仍不清楚[8-9]。阪崎克羅諾桿菌具有一些重要的與毒力或應激生存相關的因子，其中最重要的是耐干燥和滲透壓能力相關的因子，使其能夠在各種不利環境條件下持續生存[10]，在嬰兒配方奶粉中長時間存活的能力是阪崎克羅諾桿菌致病機制比較根本的特性[11]。這種強大的生存能力，以及感染嬰兒后高達80%的死亡率，也是使阪崎克羅諾桿菌作為新興的胃腸道病原體得到廣泛的關注的重要原因[12]。本研究通過干燥試驗篩選出了耐干燥能力較強和較弱的阪崎克羅諾桿菌菌株，并通過多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）對所有菌株的分子流行特征進行研究，以期獲得阪崎克羅諾桿菌耐干燥性與MLST 分型之間的關系，為進一步開展奶粉的安全控制、阪崎克羅諾桿菌的分子流行病學研究以及防控耐干燥菌株的暴發流行提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

35 株阪崎克羅諾桿菌分離株均為天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室保存菌種，如表1所示。本試驗所用到的菌株，已經過16s rRNA 基因測序與生理生化鑒定，確定為克羅諾桿菌屬中的阪崎克羅諾桿菌。所有菌株用甘油溶液保存于-80 ℃冰箱。

表1 本研究中用到的阪崎克羅諾桿菌菌株Table 1 C.sakazakii Strains used in this study

1.2 儀器設備和試劑

HVA-85 全自動壓力蒸汽滅菌鍋：日本Hirayama；5418R 臺式冷凍離心機：德國Eppendorf 公司；TProfes sional Thermal Cycler PCR 儀：美國 Biometra 公司；Gel Doc 2000 凝膠成像儀：美國Bio-Rad 公司；Sunrise Basic 酶標儀：Tecan，Austria；DYY-6C 電泳儀：北京六一儀器廠；96 孔細胞培養板：韓國SPL Life Sciences 公司。細菌DNA 提取試劑盒：北京天根生物有限公司；膠回收試劑盒、DNA 提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；蛋白胨、酵母浸取物：Oxoid 公司；NaCl：國藥集團化學試劑有限公司；Agar Power：北京索萊寶科技有限公司；所需引物均由金唯智生物有限公司合成。

1.3 耐干燥能力強阪崎克羅諾桿菌菌株的篩選

將實驗室保存的35 株阪崎克羅諾桿菌，在LB（luria-bertani，LB）固體培養基上三區劃線，37 ℃培養12 h～18 h，挑取單克隆菌落，轉接至含有1 mL LB 液體培養基的96 深孔板中，37 ℃，200 r/min 過夜培養。然后，以1 ∶100 的體積比將菌液轉接至新的96 深孔板中，于 37 ℃，200 r/min 培養 2 h～3 h，用紫外分光光度計測其OD600值，并通過稀釋將所有菌株的OD600值達到0.6 左右。吸取10 μL 菌液于96 細胞培養板中，每個菌株重復3 次。后將96 細胞培養板置于滅菌的干燥器中（內有500 g 脫水硅膠）。最后，把置有96 細胞培養板的干燥器放于培養箱中，45 ℃培養3 h，待菌液完全干燥后將培養箱溫度調至25 ℃，繼續干燥6 d。期間，分別在干燥第1 天、第6 天時各取出1 個96 細胞培養板，吸取100 μL LB 液體培養基于每孔中，37 ℃，200 r/min 培養 3 h，測取 OD600值。

1.4 阪崎克羅諾桿菌的MLST分型

1.4.1 阪崎克羅諾桿菌DNA 的提取

利用細菌基因組DNA 提取試劑盒對實驗室保存的阪崎克羅諾桿菌菌株的基因組DNA 進行提取，試驗操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4.2 阪崎克羅諾桿菌管家基因的擴增及測序

結合參考文獻[13]和MLST 數據庫的資料，選取阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894 的7 個管家基因作為目的基因：atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB 和 pps，分別編碼ATP 合成酶β-亞基、伸長系數、谷氨酰-tRNA 合成酶、谷氨酸合酶大亞基、DNA 促旋酶B、翻譯起始因子IF-2 和磷酸烯醇式丙酮酸合酶。基因位點和引物名稱、序列及其片段大小見表2。

表2 阪崎克羅諾桿菌中7 個管家基因擴增和測序引物Table 2 Oligonucleotide primer sequences for the amplification and sequencing of the seven loci from genes in C.sakazakii

7 個管家基因所用的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系經優化后，最終確定為 25 μL擴增體系。PCR 擴增程序為，94 ℃預變性 2 min，94 ℃變性 30 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸，總共 30 個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳呈現，目標條帶大小參照DNA Marker 指示，條帶單一且明亮，則可進行后續的擴增產物純化及測序分析。

PCR 產物的測序工作委托金唯智生物有限公司完成。使用測序引物對目的片段的DNA 序列進行雙向測序，產物由3730xl DNA Analyzer 進行分析。

1.4.3 阪崎克羅諾桿菌管家基因的序列編輯及分型

將所得的阪崎克羅諾桿菌7 個管家基因序列進行拼接，并提交MLST 數據庫進行比對，每個菌株可以得到相對應的各個等位基因的序列號，7 個管家基因的等位基因序列編號組合即為該菌株的ST 型。

1.5 系統發育樹的繪制

將所有菌株的7 個等位基因序列按一定順序串聯起來，使用Mega 6.0 對序列進行比對，并采用Neighbour-Joining 法構建系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌耐干燥性比較

本試驗對35 株阪崎克羅諾桿菌進行了干燥試驗，試圖篩選出其中抗干燥能力較強的菌株，見圖1。

圖1 阪崎克羅諾桿菌干燥6 d 的失活率Fig.1 The inactivation rate of Cronobacter sakazakii after drying for 6 days

結果表明 1 號（IQCC10409）、6 號（IQCC 10455）和31 號（110609-3）菌株在第6 天表現出較其他菌株更強的抗干燥能力（如圖1），經過6 d 處理失活率分別為63.73%、56.94%和 44.43%。而2 號（IQCC10410）、11號（ENS6309-4）和 17 號（ATCC 12868）菌株在第 6 天表現出較其他菌株較弱的抗干燥能力，經過6 d 處理失活率分別為91.54%、96.06%和96.75%。因此，31號菌株耐干燥能力最強。

2.2 阪崎克羅諾桿菌的MLST分型

將35 株阪崎克羅諾桿菌菌株進行MLST 分型，一共得到了16 個不同的ST 型，如表3所示。

表3 阪崎克羅諾桿菌分離株MLST 分型結果Table 3 MLST result of C.sakazakii isolates

其中，屬于 ST1 型（20、24、27、28、33）和 ST4 型（4、6、7、9、11）的菌株較多，分別有 5 株菌，各占總菌株的14.3%；屬于ST73 型和ST199 型分別有3 株，占總菌株的8.6%；屬于ST8 型有2 株，占總菌株的5.7%；此外，還包含 ST23、ST136、ST266、ST13、ST40、ST60、ST240、ST373、ST223、ST442、ST282 型以及 6 株未能在數據庫中找到的新ST 型。

續表3 阪崎克羅諾桿菌分離株MLST 分型結果Continue table 3 MLST result of C.sakazakii isolates

耐干燥能力較強的1號（IQCC10409）、6 號（IQCC10455）、和31 號（110609-3）菌株分別屬于ST73、ST73 和 ST23 型，而耐干燥能力較弱的 2 號（IQCC10410）、11 號 （ENS6309-4） 和 17 號（ATCC 12868）菌株分別屬于ST1、ST8 和ST282 型。結合耐干燥能力與MLST 分型可知，阪崎克羅諾桿菌基因多樣性程度較高，其中，ST73 型耐干燥能力較強。另外，將試驗所用35 株菌的耐干燥能力進行排序，其中耐干燥性較強的菌株中ST4 型有5 株，ST73 型有2 株；耐干燥性較弱的菌株中ST1 型有5 株，ST199 型有3 株。說明ST4 型菌株表現出較強耐干燥能力，而ST1 型耐干燥能力較弱。另外，通過比較不同菌株的耐干燥能力，發現即使相同ST 型的菌株，其耐干燥能力也不同，說明不同的阪崎克羅諾菌株間存在較強的個體差異性。

2.3 MLST分型與耐干燥的相關性

利用Mega 6.0 軟件分析阪崎克羅諾桿菌菌株MLST 分型數據所得到的系統發育樹見圖2。

圖2反映了菌株之間的親緣關系的遠近，可以直觀地表現出分型與耐干燥之間的聯系。通過分析某些特定的ST 型和相關耐干燥模式之間的聯系，MLST 可能成為追溯阪崎克羅諾桿菌耐干燥菌株來源的有力工具，本研究中所涉及阪崎克羅諾桿菌菌株呈現出較高的基因多樣性，不同來源的阪崎克羅諾桿菌分屬于較為廣泛的ST 型中。

3 討論

阪崎克羅諾桿菌具有多種致病因子，能引起危及生命的疾病、嚴重的慢性后遺癥或是長時間的疾病。很多報道指出，PIF 是克羅桿菌屬的主要來源和載體[14-15]。因此，許多國家對于PIF 中這種病原體的監測已經越來越多重視。此外，阪崎克羅諾桿菌是一種抗干燥能力較強的菌種，能在奶粉中長期存活，其易在奶粉復水時大量繁殖。因此，研究阪崎克羅諾桿菌的分型與其耐干燥性的關系非常重要。本研究中，Cronobacter sakazakii IQCC10409、Cronobacter sakazakii IQCC10455 和 Cronobacter sakazakii 110609-3 菌株的抗干燥能力較強（如圖1），其中Cronobacter sakazakii 110609-3 菌株耐干燥能力最強，屬于ST23 型，而Cronobacter sakazakii IQCC10409 和 Cronobacter sakazakii IQCC10455 也表現出較強的耐干燥能力，它們都屬于ST73 型，這說明ST73 型屬于耐干燥能力較強的MLST 型。另外，對試驗所用35 株菌的耐干燥能力進行排序，耐干燥性較強的菌株主要集中于ST4型。Fei Peng 等[16]研究表明ST4 型耐干燥能力較強，與本試驗結果一致。這可能解釋ST4 型阪崎克羅諾桿菌是從嬰兒配方奶粉中分離出來的常見基因型的主要原因之一。以上的研究不僅有助于更好地了解阪崎克羅諾桿菌的在食品環境中的存活性，還有助于為分子流行病學調查以及預防和控制該菌的流行提供支持。

圖2 阪崎克羅諾桿菌菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of C.sakazakii isolates