徂徠山病死松樹中線蟲的分離及鑒定

高 鋒，趙 濤，陳海燕，王怡霖，劉會香

（1.山東泰安市徂徠山林場，山東泰安271027； 2.山東農業大學植保學院，山東泰安271000）

徂徠山地處魯中山區的中心位置，植被覆蓋率達到了87.8%,具有重要的生態價值[1]。 松林面積達4400hm2，主要樹種有油松、赤松、黑松。 目前徂徠山未發生松材線蟲病，但隨著松材線蟲病的不斷擴散蔓延，傳入徂徠山的風險不斷增加，為確保徂徠山松林資源安全，每年定期開展松材線蟲病的普查和抽樣檢測工作，為探究徂徠山松樹死亡原因，是否與松材線蟲或擬松材線蟲有關系，本研究調查了徂徠山10 個林區，采集了969 個樣品，從形態學、分子生物學等方面對所分離到的線蟲進行分析和評價。

擬松材線蟲( Bursaphelenchus mucronatus) 屬傘滑刃屬， 在形態上與引起松樹萎蔫病( Pine Wild Disease) 的松材線蟲（B.xylophilus）極其相似。 早期研究認為，擬松材線蟲致病力弱，在松樹受到惡劣環境的影響或者松樹被其他有害因子危害造成樹勢衰弱時，才會加速松樹枯死[2-4]。 近年來，我國部分非松材線蟲病發生區域也出現了大面積松林死亡，但是在死樹中并沒檢測到松材線蟲，卻發現擬松材線蟲[5-6]。 說明擬松材線蟲對一些松樹有較強致病性。 現有研究表明，擬松材線蟲致病性存在三類分化：第一類是強致病力，致死率大于85%；第二類是微弱致病力和潛在致病力，在環境適宜條件下能夠造成比較嚴重危害；第三類是無致病力[7-8]。 相比松材線蟲而言，擬松材線蟲分布更為廣泛，徐紅梅等研究發現， 在某些地區經常是擬松材線蟲先出現，之后才有松材線蟲出現[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

2016-2018年定期在山東省泰安市徂徠山林場10 個林區，采集瀕死木，刮除外皮后取木質部碎片，共采集969 個松樹樣本，帶回室內進行檢測。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測

采用貝爾曼漏斗法。 吸取收集到的液體50μL，顯微鏡觀察是否有線蟲及特征。

1.2.2 線蟲鑒定

使用毛細管，挑取一定數量待檢線蟲在顯微鏡下觀察其形態，觀察線蟲的大小和形態。 分子鑒定參照趙立榮（2005）所使用的線蟲通用引物和松材線蟲和擬松材線蟲特異性引物[10]，然后挑取單條線蟲，置于PCR 管中，先液氮浴中1 min，然后85℃水浴2min， 重復該步驟兩次。 后加入蛋白酶K 2μL，56℃處理15 min 和95℃處理10min。 選用Taq MIX酶進行PCR 擴增，產物送至北京華大公司測序。 將測定的菌株序列提交到NCBI 上進行BLAST 比對，確定菌株的分類地位。

使用MEGA6 軟件進行系統進化分析， 采用Neighbor joining method。 參比序列及GenBank 分類號為：Bursaphelenchus mucronatus （KF025318.1 、JQ729986.1、JQ729987.1、JF751070.1、JF317235.1、EF446953.1、EU296624.1、AM400247.1、AM400246.1、AY347916.1、AY347915.1、AY347914.1、JQ729985.1、MH923204.1）；Bursaphelenchus xylophilus（MH173065.1、MH173064.1、MH173062.1、MH173061.1、MH173060.1、MH172328.1、MH172326.1 、MH172325.1）。

2 結果與分析

2.1 分離線蟲的鑒定

2.1.1 形態學特性

顯微觀察表明，徂徠山松木里面的線蟲主要有兩種，一種線蟲雌蟲尾部呈圓椎形，尾端指狀，有明顯的尾尖突，尾尖突長度約為3.80-5.71μm（圖1）。角質層薄，上面布滿圓形小環；唇區高，縊縮明顯；口針基部增大；細長的食道腺覆蓋于腸道上方，長度約為4 個體寬；神經環緊接在中食道球后方。 初步鑒定了擬松材線蟲（圖2）；另一類線蟲為口針退化，尾尖突細長，為腐生線蟲（圖3）

圖1 擬松材線蟲尾尖突

圖2 擬松材線蟲的口針及中食道球

圖3 腐生性線蟲形態特征

2.1.2 分子鑒定

圖4 PCR 擴增的結果，M 為DM5000 maker，1、2 為擬松材線蟲

對多批次的線蟲樣品進行總DNA 提取， 按照松材線蟲和擬松材線蟲的特異引物進行PCR 擴增，其PCR 產物大小約為250bp （圖4） 產物序列測定和 Blast 分析對比。 其均為擬松材線蟲（Bursaphelenchus mucronatus）。 基于ITS 序列的聚類分析也表明它們與擬松材線蟲聚在一起（圖5）。綜合形態學與分子生物學特征，確認送檢的線蟲均為擬松材線蟲。

圖5 所檢測樣品ITS 的NJ 系統進化分析

2.2 松木樣品檢測

徂徠山各林區松木樣品送檢檢測結果見表1。

通過表1 可以看出， 徂徠山的10 個林區均發現了死亡的松樹，其中茶石峪林區和徂徠林區所發現的死亡松樹最多， 太平頂景區和上池植物園最少。 所發現死亡松樹的主要樹種為赤松， 占比達88.5%，其次為黑松占比為11.5%。 在所有死亡的松樹樣品中，存在大量藍變現象，藍變率為73.1%，樣品中檢測到了大量線蟲，線蟲的檢出率為63.2%，其中擬松材線蟲檢出率為54.5%， 腐生性線蟲檢出率為8.7%；在不同樹種的樣品中，58.0%的赤松樣品中檢測到了擬松材線蟲，27.0%的黑松樣品中檢測到了擬松材線蟲， 說明赤松對擬松材線蟲對更為敏感。

3 結論與討論

3.1 本研究調查了徂徠山10 個林區， 采集了969個樣品，從線蟲形態學、分子序列測定方面進行了鑒定和測定。 研究顯示，在徂徠山衰弱、病死木中發現了大量的擬松材線蟲（Bursaphelenchus mucrona-tus）和腐生性線蟲。

表1 徂徠山不同林區松木樣品檢測結果

3.2 此前的報道中，擬松材線蟲對赤松（Pinus densiflora Sieb. et Zucc）、黃山松（Pinustaiwanensis hayata）和黑松（P. thunbergiiparl）、云南松（P.yunnanensis faranch）、思茅松（P. kesiya royle ex gordon var.langbianen）和高山松（P.densata）等的危害均有報道，常導致很多松林被毀[11-14]。 之前的一些報道中將擬松材線蟲的致病力分為3 種:致病力很強,致死率大于85%的種群、較強的致病潛能的,在環境適宜的情況下可能造成嚴重危害的種群和幾乎沒有致病力的種群[7-8]。 徂徠山10 個林區松樹死亡情況存在差異，茶石峪林區林區和徂徠林區所發現的衰弱和死亡松樹最多， 太平頂景區和上池植物園最少，赤松死亡現象嚴重，占到了總調查數量的88.5%，黑松次之，黑松僅占到了11.5%，赤松上藍變現象明顯，擬松材線蟲數量大，而黑松藍變現象不明顯，擬松材線蟲數量少，說明徂徠山松樹上的擬松材線蟲與松樹品種關系密切，是赤松死亡的主要原因，而黑松死亡可能與其它因素有關。

3.3 藍變菌是指那些能把樹木木質部染成藍色或者藍黑色的真菌類群，大多數藍變菌都屬于長嚎殼類真菌。 有相關的研究表明，藍變菌和松材線蟲一起隨媒介昆蟲侵入健康的松樹體內, 感病松樹出現異常后,藍變菌會在樹干中從上向下擴散。木材有無藍變現象也是判斷松木是否感染松材線蟲的一個重要指標。同時藍變菌是松材線蟲最好的食物,對松材線蟲的快速繁殖起一定作用[15]。 本試驗采集了大量的松木樣品，發現了大量的藍變的松木，但是在藍變的松木中卻并沒有檢測到松材線蟲。 藍變的松木樣品中檢測到了擬松材線蟲，說明藍變菌也與擬松材線蟲有著密切的關聯，它們之間的關系還有待下一步探究。 另外在線蟲檢測中還發現有死亡松樹木材中有變紅現象，具體由哪一類病原引起有待進一步研究。