醬香型白酒中吡嗪類物質體外抗炎作用研究

羅 強，劉 杰，劉志剛*

（深圳大學 醫學部，廣東 深圳 518000）

白酒通常是由淀粉或其他含有糖質的原料經過多種工序而獲得的蒸餾酒[1]。白酒不僅供日常飲用，也是一種重要的藥材，有活血通脈、助藥力、增進食欲等作用，如張仲景的《金匱要略》中記載的瓜蔞薤白白酒湯是中醫治療胸痹的著名方劑，現代醫學研究也證實瓜蔞薤白白酒湯對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[2]、對冠心病的治療也有很好的效果[3]。醬香型白酒為中國白酒典型的白酒香型之一，其獨特的制酒工藝造就了獨特的風味[4]。據文獻報道，醬香型白酒含有多種吡嗪類化合物，其含量高達63.6 mg/L[5]，遠高于普通白酒。人類使用香料作為增味劑具有悠久的歷史，近年研究表明，吡嗪類化合物存在于多種香料中[6]；同時，研究顯示部分吡嗪類化合物具有一定的生物活性，如含吡嗪環的噻唑啉、噻唑烷酮具有優秀的抗菌作用[7]、川芎嗪對紅藻氨酸誘導的大鼠海馬興奮性毒性具有保護作用[8]、可保護大鼠大腦免受缺血再灌注損傷[9]及改善體內的肝臟炎癥[10]等。

在炎癥的發生和發展過程中會伴隨著一系列的理化性質的改變，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide，NO）等含量變化[11-12]，同時花生四烯酸代謝通路中前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）也在炎癥發生、發展過程中的也起到很重要的作用[13]。有研究顯示，誘異型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）通常可由細胞因子和微生物內毒素等炎性物質誘導表達，從而產生持續高水平的NO[14]；同樣的，前列腺素E2（PGE2）是由花生四烯酸通過環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）產生[15]；細胞因子TNF-α、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）與PGE2均為引起炎性反應的關鍵因子；而血紅素氧合酶（heme oxygenase-1，HO-1）的表達上調可抑制多種免疫效應功能[16]。

醬香型白酒中含有多種吡嗪類物質，其中三甲基吡嗪、四甲基吡嗪含量較高[17]，但由于乙醇、水及其他物質的存在，其相關生物活性研究鮮有報道。因此，本實驗建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導RAW264.7細胞炎癥模型，并通過酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定細胞上清液中一氧化氮（NO）、白細胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，進而檢測誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環氧化酶-2（COX-2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、白細胞介素-1（IL-1）、IL-6、TNF-α的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表達及對花生四烯酸代謝通路中與有關生成前列腺素E2（PGE2）關鍵酶的影響，研究吡嗪類化合物對炎癥模型中誘導型合酶iNOS及相關炎癥因子的變化等，探討其抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株：美國ATCC公司；醬香型白酒（53度）：貴州茅臺集團；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸鹽緩沖液（phosphatesalinebuffer，PBS）：廣州瑞舒生物科技有限公司；RPMI1640培養基：美國HyClone公司；0.25%胰蛋白酶：美國Gibco公司；酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒：碧云天生物科技有限公司；SYBR@PrimeScriptTM逆轉錄聚合酶鏈反應（reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR）試劑盒：大連TaKaRa公司；活細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）：佰易聚生物商城；2-甲基-3-丙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-異丁基-3-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二吡嗪、2-丙基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-異丙基吡嗪：阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IC型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；INCO2108 型CO2培養箱：德國Memmert公司；TECAN infiniteM200多功能酶標儀：美國ThermoFisherScientific公司；2K15型低溫高速離心機：美國Sigma公司；R2487高效液相色譜（highperformance liquidchromatography，HPLC）：美國Waters公司；Agilent 1200液質聯用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）：美國Agilent公司；Epics Altra型流式細胞儀：美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 醬香型白酒中非乙醇類物質的提取及吡嗪類溶液的配制

250 mL分液漏斗中加入50 mL白酒、20 mL水和90 mL氯仿，振蕩搖勻、靜置，分離氯仿層，重復3次，合并氯仿層。用旋轉蒸發儀（4℃）除去氯仿獲得有機層化合物。真空凍干水層得水層化合物，合并有機層及水層化合物為酒中非乙醇類物質（Jiu non-ethanol，JNE），-20℃避光保存。參照文獻方法，利用液質聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法檢測酒中非乙醇類物質（JNE）[18]，用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）檢測酒中吡嗪類化合物的含量[19]。吡嗪類化合物及酒中非乙醇類物質（JNE）溶于PBS，初始質量濃度為10 mg/mL，-20℃避光保存備用。

1.3.2 細胞培養

RAW264.7細胞培養于含有10%FBS的RPMI 1640培養基，培養于37℃、5%CO2、90%相對濕度的培養箱內[20]。將細胞濃度調整為2×105個/mL，并按100 μL/孔接種于96孔板中，在細胞培養板中分別加入0.01 mg的吡嗪類化合物及酒中非乙醇類物質（JNE），終質量濃度為0.10 mg/mL，將處理好的96孔細胞培養板置于培養箱中培養24 h后，每孔加入0.1 μg的LPS，終質量濃度為1.0 mg/L，置于培養箱中培養4 h，CCK-8檢測細胞活力。

將細胞濃度調整為2×105個/mL，并按100 μL/孔接種于96孔板中，將實驗分為6組：①正常組：正常培養，未對細胞做任何處理；②LPS組：細胞在96孔細胞培養板中培養24 h后，加入0.4 μg/孔，終質量濃度為2.0 mg/L的LPS培養6 h；③酒精+LPS組：96孔細胞培養板中加入0.024 mg乙醇∶水（53∶47，V/V），終質量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細胞培養板置于培養箱中培養24 h后，加入0.4 μg/孔，終質量濃度為2.0 mg/L的LPS培養6 h；④白酒+LPS組：96孔細胞培養板中加入0.024 mg白酒，終質量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細胞培養板置于培養箱中培養24 h后，加入0.4 μg/孔，終質量濃度為2.0 mg/L的LPS培養6 h；⑤JNE+LPS組：96孔細胞培養板中加入0.024 mg酒中非乙醇類物質（JNE），終質量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細胞培養板置于培養箱中培養24 h后，加入0.4 μg/孔，終質量濃度為2.0 mg/L的LPS培養6 h；⑥吡嗪化合物-5（Biqin-5，BQ-5）+LPS組：96孔細胞培養板中加入0.024 mg BQ-5，終質量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細胞培養板置于培養箱中培養24h后，加入0.4μg/孔，終質量濃度為2.0mg/L的LPS培養6 h。CCK-8檢測化合物對細胞活力的影響及流式細胞術檢測細胞凋亡的情況[21]。采用ELISA試劑盒測定NO、IL-1、IL-6、TNF-α等相關炎癥因子及PGE2濃度[22]。細胞裂解后收集裂解物，提取RNA，采用定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）測定iNOS、COX-2、HO-1、IL-1、IL-6、TNF-α等基因表達的量。

1.3.3 RNA提取及cDNA的合成

將細胞濃度調整為2×105個/mL，并按2 mL/孔接種于6孔板中，在細胞培養板中分別加入0.48 mg的白酒、BQ-5、JNE和乙醇∶水（53∶47，V/V），終質量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的6孔細胞培養板置于培養箱中培養24 h后每孔加入4 μg的LPS，終質量濃度為2.0 mg/L，置于培養箱中培養6 h后，取出6孔板，將孔內的培養基吸出，并加入0.50 mL Biozol Reagent裂解細胞，收集細胞裂解液于2.0 mL離心管，室溫靜置2 min后加入0.10 mL氯仿，劇烈振蕩15 s混勻，靜置3 min。在4 ℃、12 000×g條件下離心4 min，取上層水相加入等量異丙醇，漩渦振蕩，室溫放置10 min；12 000×g條件下離心10min，棄上清，沉淀中加入1.0mL體積分數為75%乙醇洗滌，室溫干燥后加入30 μL的焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解即得總RNA，其OD260nm/280nm值為1.8～2.0。互補脫氧核糖核酸（complementarydeoxyribonucleic acid，cDNA）的合成按SYBR@PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒操作說明進行，產物保存于-20℃，備測。

1.3.4 PCR擴增

iNOS、COX-2、HO-1、IL-1、IL-6、TNF-α和β-肌動蛋白（β-actin）cDNA參照GenBank中公布的序列，利用Primer5.0軟件設計引物，由吉賽生物技術有限公司（廣州）合成。PCR擴增具體實驗采用總反應體積10.0 μL體系：SYBR-Premix ExTaqTMⅡ 5 μL，10 μmol/L由吉賽生物技術有限公司合成的上述7種蛋白的cDNA引物2.0 μL，cDNA模版1.0 μL，雙蒸水2.0 μL。PCR反應條件：預變性95℃10 s，變性95℃5 s，熒光檢測72 ℃ 10 s，40個循環。

1.3.5 數據處理

所有數據采用SPSS 18軟件進行統計。對陰性對照和陽性對照采用獨立樣本t檢驗，對BQ-5處理效應進行回歸分析。P＜0.05表明具有顯著差異，P＜0.01表明具有極顯著差異，結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 吡嗪類化合物對RAW264.7細胞的毒作用

對不同的吡嗪類化合物單體以一定濃度加入細胞培養液中，用CCK-8檢測細胞活性。結果顯示，吡嗪類化合物質量濃度低于0.35mg/mL時，細胞增殖能力與對照組相比，差異均無顯著性（P＞0.05），表明吡嗪類化合物的濃度在一定范圍內對細胞無明顯毒性（以下研究吡嗪類化合物質量濃度均＜0.35 mg/mL）。此外，0.10 mg/mL的吡嗪類化合物與RAW264.7細胞共培養24 h后，加入0.1 μg/孔，終質量濃度為1.0 mg/L的LPS培養4 h，CCK8檢測細胞增殖，用正常細胞不做任何處理作為空白對照，LPS作為陽性對照。結果見表1。

表1 吡嗪類化合物對RAW264.7細胞增殖能力影響Table 1 Effect of pyrazines on proliferation of RAW264.7 cells

由表1可知，相比于對照（Control）組，LPS組細胞增殖顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率為18.9%，上升18.9%。而相比于LPS組，與BQ-5、BQ-9、BQ-10共培養24 h后，細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。其他吡嗪類化合物則對細胞凋亡率未有明顯影響（P＞0.05）。其中，BQ-5處理的細胞凋亡率為（8.5±7.26）%，相比于其他組，對增強細胞抗LPS刺激產生損傷的能力最強。不同于BQ-5組，白酒及乙醇組細胞存活率均低于LPS處理組，推測可能是由于乙醇降低了細胞抗LPS刺激產生損傷的能力。因此，選擇BQ-5進行進一步的研究。

2.2 BQ-5對RAW264.7細胞凋亡及NO，PGE2，TNF-α等相關炎癥因子的影響

為了便于比較，將正常組的NO、TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2濃度設為1，其他組濃度為相對值，BQ-5對PGE2、NO及TNF-α等相關炎癥因子的影響結果見表2，其抗LPS誘導的RAW 264.7細胞凋亡作用，結果見圖1。由表2可知，LPS刺激RAW 264.7細胞使NO、IL-6、IL-1、TNF-α及PGE2分泌顯著升高（P＜0.05）。而BQ-5組與LPS組相比，TNF-α、NO、PGE2及IL-1的含量均顯著降低（P＜0.05），IL-6含量無顯著性差異（P＞0.05）。結合圖1結果可以說明，BQ-5能有效的降低LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子的產生，同時提高細胞抗LPS損傷的能力。不同于BQ-5組，白酒及乙醇組中TNF-α、NO、IL-1及IL-6的含量均高于LPS組。推測可能是乙醇對細胞的損傷作用導致的。有趣的是JNE中TNF-α、NO、IL-1及IL-6的含量均低于LPS組，其原因可能是白酒中的其他物質增強了細胞的抗LPS損傷的能力。

圖1 BQ-5抗LPS誘導的RAW264.7細胞凋亡作用Fig.1 Antagonistic effect of BQ-5 on LPS-induced RAW264.7 cells apoptosis

表2 BQ-5對PGE2、NO及TNF-α等相關炎癥因子的影響Table 2 Effect of BQ-5 on PGE2,NO,TNF-α and other related inflammatory factors

2.3 BQ-5對LPS誘導的PLA2、COX-2活性的影響

BQ-5對LPS誘導的PLA2、COX-2活性的影響結果見圖2。由圖2可知，LPS誘導后，PLA2、COX-2的活性顯著增加（P＜0.05），而JNE和BQ-5對PLA2、COX-2的活性具有不同程度的抑制作用（P＜0.05），但白酒及乙醇組中PLA2、COX-2的活性反而顯著增加（P＜0.05），推測是乙醇對細胞的損傷協同LPS誘導PLA2、COX-2的活性上升的。

圖2 BQ-5對LPS誘導的PLA2、COX-2活性的影響Fig.2 Effect of BQ-5 on LPS-induced PLA2 and COX-2 activities

2.4 BQ-5對LPS誘導的細胞炎性介質（IL-1、IL-6、TNF-α）

及誘導型合酶（iNOS、COX-2、HO-1）基因表達的影響

BQ-5對LPS誘導的細胞炎性介質及誘導型合酶基因表達的影響結果見圖3。同樣的，為了便于比較，將正常組的iNOS、COX-2、HO-1、IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表達量設為1，其他組表達量為相對值。由圖3可知，相比于正常組，LPS誘導后誘導型合酶iNOS、COX-2、HO-1 mRNA的表達分別是正常組的56.2倍（P＜0.01）、13.7倍（P＜0.01）及3.97倍（P＜0.05）。相比于LPS組，BQ-5組的誘導型合酶iNOS、COX-2 mRNA的表達分別下降40.1%（P＜0.05）、59.7%（P＜0.05），HO-1沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 BQ-5對LPS誘導的細胞炎性介質（A）及誘導型合酶（B）基因表達的影響Fig.3 Effect of BQ-5 on LPS-induced cellular inflammatory mediators(A)and inducible synthase(B)gene expression

相比于正常組，LPS誘導后細胞炎性介質（IL-1、IL-6、TNF-α）的mRNA表達增加分別是正常組的78.7倍（P＜0.01）、35.3倍（P＜0.01）及5.63倍（P＜0.05）。相比于LPS組，BQ-5組的IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達分別下降59.6%（P＜0.05）、69.4%（P＜0.05）、67.5%（P＜0.05）。

不同于BQ-5可降低細胞炎性介質及誘導型合酶mRNA的表達，白酒及乙醇未表現出類似的作用。JNE對細胞炎性介質及誘導型合酶mRNA的表達的影響與BQ-5類似，推測是白酒中的非乙醇類物質發揮的作用。

3 結論

本實驗針對醬香型白酒中吡嗪類化合物對LPS誘導RAW264.7細胞損傷及對相關炎癥因子表達的影響進行了研究。首先用CCK-8檢測白酒中含有的各種吡嗪類化合物細胞活性的影響，其中醬香型白酒中吡嗪類化合物（BQ-5）處理細胞后，細胞凋亡率為（8.5±7.26）%，相比于其他化合物，對LPS誘導的細胞損傷的保護性更強。然后將實驗分為6組，用流式細胞術檢測6組細胞的凋亡情況，其中BQ-5處理的細胞存活率為（8.6±2.28）%，是6組中除空白組外最高，進一步說明BQ-5對細胞保護作用。提取上述各組細胞的mRNA和炎癥因子，檢測其中NO、TNF-α及IL-1的生成與釋放，相比于LPS組，iNOS、TNF-α及IL-1的基因表達分別下降23倍、4.6倍、46.6倍；相比于LPS組，NO、TNF-α及IL-1的釋放量分別下降0.98倍、0.41倍、4.73倍，說明BQ-5能顯著降低NO、TNF-α及IL-l的生成與釋放（P＜0.05）。同時檢測COX-2、PLA2的活性變化、COX-2的基因表達情況和PGE2的釋放情況，BQ-5處理組的COX-2、PLA2的相對活性與LPS組相比，分別降低44%和71%，COX-2的基因表達量降低8.18倍，PGE2的釋放量降低42%，結果表明，BQ-5可通過抑制PLA2活性和COX-2表達而減少PGE2合成，這可能是BQ-5抗炎的另一主要作用機制。由此可以推測BQ-5可能通過調節巨噬細胞產生NO及TNF-α等炎癥因子來發揮作用的。

本研究顯示醬香型白酒中的非乙醇成分及吡嗪類化合物（BQ-5）具有直接的抗LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥作用，說明醬香型白酒中的吡嗪類物質具有增強細胞抗炎性損傷的能力。其發揮抗炎作用與減少RAW264.7細胞炎癥介質生成與釋放、抑制花生四烯酸代謝途徑PGE2的合成的關鍵酶活性密切相關。同時，分析實驗結果發現，醬香型白酒及酒精組未顯示出任何增強細胞抗炎能力，推測其中的乙醇降低了細胞的抗炎能力。