響應面優化北五味子米酒發酵工藝研究

劉 洋

（長春職業技術學院 食品與生物技術學院，吉林 長春 130033）

北五味子（Schisandra chinesis（Turcz.）Bsill.）產于吉林、遼寧、黑龍江、內蒙古等地，因其藥用價值高，應用范圍廣，在國內外久負盛名。其果實粒大、肉厚、光澤好，有油性，藥用成分高，療效顯著[1]。北五味子果實中含揮發油、檸檬酸、蘋果酸、維生素C、維生素E、樹脂、鞣質、多種氨基酸及少量糖類物質，還含有7種木脂素類化合物，如五味子酯甲、酯乙、醇甲、醇乙、甲素、乙素、丙素等[2-5]，研究表明這些成分多具有鎮靜[6]、鎮痛[7]、鎮咳[8]、延長睡眠時間[9]等藥理作用，能降低血清谷丙轉氨酶[10]、抗癌、抗艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、拮抗血小板活化因子和抑制醛糖還原酶等多種活性，并且可以增強人體免疫力等功效等。臨床上主要用于治療失眠、焦慮、慢性肝炎、心臟病、腎虛久咳、降血脂、肺炎抗腫瘤等癥[11-15]。

近年來采用傳統生物發酵技術開發出五味子系列保健食品，包括五味子葡萄酒、啤酒、果醋、酸奶等，但在五味子米酒研究領域實屬空白。北五味子果漿中富含單糖類、氨基酸、揮發油、有機酸、多種維生素等多種生理活性物質及K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Si等礦物質元素，能增強五味子發酵酒香氣及口感；米酒酒香濃郁，香甜醇美，含有8種人體自身不能合成而又必需的氨基酸，其中賴氨酸的含量比葡萄酒要高出數倍，為世界其他營養酒類中所罕見，具有健脾養胃、補養氣血、舒筋活血、祛風除濕的功效，是產婦和老年人的滋補佳品[16]。

吉林省是我國大米的主產區，年產量達到600多萬t，約占東北大米總產量的24%，而且大米的感官品質極佳，晶瑩剔透、香甜軟糯，大米中淀粉含量占75%左右，淀粉作為多糖是釀酒的主要原料，在適宜的發酵條件下可以分解產生糊精、葡萄糖、麥芽糖等低聚糖，不但可用于酒曲中微生物生長繁殖，還可被霉菌、酵母菌利用產生酒精。延邊大學的張玲[17]選用大米為主要原料制備米酒，詳細闡述了制作工藝及操作要點。鑒于應用大米制作米酒存在先例并具有可行性，因此，本研究以吉林省農產品大米為主要原料釀造五味子米酒，并通過其發酵工藝優化，將五味子功能特性及營養成分引入米酒制作中，形成酸甜可口的特殊風味，改善傳統米酒的口感，提高傳統米酒的營養價值及保健功效，為打造新一代高端功能性飲品提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子（Schisandra chinesis（Turcz.）Bsill.）：吉林省蛟河市；大米：吉林省永吉縣；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；硫酸銅、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LB50T手持糖度計：深圳市德優平科技有限公司；SPM-808智能生化培養箱：寧波江南儀器廠；HH-8型恒溫水浴鍋：常州迅生儀器有限公司；Alcomat Super酒精度測試儀：北京三思智業科技有限公司；FA系列電子分析天平：上海越平科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子米酒發酵工藝流程及操作要點

北五味子果漿制備：9月上旬，選擇果粒飽滿的北五味子鮮果，用清水浸泡洗除表皮污物，加入0.05%的高錳酸鉀消毒，按照料液比1∶1加入水于北五味子果中，經高速剪切乳化機1 000 r/min進行打漿處理5 min，過濾渣料，測果漿可溶性固形物含量105℃滅菌15 min后以備用接種[18-19]。

浸米：原料大米凈水洗凈，加入清水浸沒，米和水的比例為1.0∶2.0（g∶mL），將大米放在30 ℃的恒溫生化培養箱中，浸米24 h，浸泡達到米粒外觀由透明變白色，手捏即碎為宜[20]。

拌曲添漿：將浸泡好的大米用蒸鍋蒸煮約45 min，蒸好的大米用約20℃的涼水淋至室溫，瀝干水分后進行落缸，加入一定量的甜酒曲，攪拌均勻；加入一定量的北五味子果漿，攪拌均勻；在米飯中央位置挖出一個倒喇叭狀的窩，以增加米飯與空氣的接觸面積，釋放熱量，便于觀察產酒情況[21]。

糖化發酵：前期糖化溫度36℃，糖化時間36～84 h；糖化結束后，將糖化醪放于20℃條件下保溫發酵24～60 h。

殺菌保藏：將米酒用發酵罐密封加熱至75℃左右殺菌15～20min，保溫30s后冷卻，冷卻后即制得北五味子米酒。

1.3.2 單因素試驗

選取北五味子果漿添加量（8%、12%、16%、20%、24%）、酒曲接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、糖化時間（36h、48 h、60 h、72 h、84 h）、發酵時間（32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）4個因素進行單因素試驗，糖化溫度為36℃、后發酵溫度為20℃，分別考察各因素對米酒理化指標及感官評分的影響。

1.3.3 北五味子米酒發酵工藝的響應面優化設計

以北五味子果漿添加量（A）、酒曲接種量（B）、糖化時間（C）、發酵時間（D）為考察因素，以感官評分為評價指標，利用Design Expert 8.0軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設計，試驗因素與水平如表1所示[22]。

表1 北五味子米酒發酵工藝條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization ofSchisandra chinesis rice wine

1.3.4 測定方法

（1）理化指標測定

斐林試劑法測定還原糖（以葡萄糖計）[23]；酒精計法測定酒精度[23]；電位滴定法測定總酸[24]。

（2）感官評價方法

選擇15名感官評定專業人員組成評定小組，參照NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》對北五味子米酒從色澤（25分）、香氣（35分）、口感（40分）3個方面進行評價，滿分為100分，具體評價標準見表2[25]。

表2 北五味子米酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards ofSchisandra chinesis rice wine

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 北五味子果漿添加量對米酒理化指標及感官評分的影響

參照上述北五味子米酒發酵工藝，設計北五味子果漿添加量分別為8%、12%、16%、20%、24%，設置甜酒曲接種量2%、糖化時間48 h、發酵時間48 h，考察北五味子果漿添加量對五味子米酒品質的影響，結果見圖1。

圖1 北五味子果漿添加量對米酒理化指標及感官評分的影響Fig.1 Effect ofSchisandra chinesisfruit pulp addition on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖1可知，當北五味子果漿添加量在8%～16%范圍內時，隨著北五味子果漿添加量的增加，米酒中酒精度、還原糖、總酸含量均呈現上升的趨勢，其中酒精度從2.51%vol增加至6.14%vol；還原糖從10.58g/100g增加至24.78g/100g；總酸含量從0.37 g/100 g增加至0.80 g/100 g；當北五味子果漿添加量在8%～16%范圍內時，北五味子米酒感官評分隨著五味子果漿添加量的增加而增加，感官評分最高可達91.1分，此時米酒中還原糖含量為16.81 g/100 g，酒精度為4.45%vol，總酸為0.65 g/100 g；北五味子果漿添加量在16%～24%范圍內時，北五味子米酒感官評分呈現降低的趨勢；當北五味子果漿添加量為24%時，北五味子米酒感官評分降至70.2分。北五味子果漿本身具有獨特的酸甜滋味，稍有咸味，與大米一起發酵，通過緩解高滲透壓對菌種的抑制而提高發酵速度，增強米酒的香氣，但北五味子果漿添加量過大，增加了甜酒曲的含水量，導致酵母發酵速度變慢，產酒量減少，米酒風味下降，酒體呈現微渾。因此，北五味子果漿最適添加量為16%。

2.1.2 甜酒曲接種量對米酒理化指標及感官評分的影響

設置北五味子果漿添加量為16%，甜酒曲接種量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，設置糖化時間48 h、發酵時間48 h，考察甜酒曲接種量對北五味子米酒品質的影響，結果見圖2。

圖2 甜酒曲接種量對米酒理化指標及感官評分的影響Fig.2 Effect of sweetJiuquinoculum on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖2可知，隨著甜酒曲接種量的增加，北五味子米酒發酵液中酒精度與總酸含量逐漸升高，還原糖含量先增高后下降。當甜酒曲接種量在1%～2%范圍內時，還原糖含量從14.43 g/100 g增加至29.87 g/100 g，甜酒曲接種量超過2.0%時，還原糖含量逐漸下降，接種量達3%時，最低還原糖含量達10.23 g/100 g，這是因為菌種發酵使糖轉化為酒精；所以酒精度保持升高趨勢，酒精度含量過高米酒口感下降，因此當甜酒曲接種量為2.5%時，米酒中還原糖含量為18.52 g/100 g，酒精度為5.80%vol，總酸含量為0.75 g/100 g，此時米酒的感官評分達最高為86.4分，甜酒曲接種量達3.0%時，米酒口感下降，有明顯的酸澀感，由于甜酒曲接種量增加，發酵體系急劇升溫，酵母菌大量繁殖，引起酸敗現象，影響米酒澄清度，感官評分降低到73.2分。因此，最適宜甜酒曲接種量為2.5%。

2.1.3 糖化時間對米酒理化指標及感官評分的影響

北五味子果漿添加量為16%，甜酒曲接種量為2.5%，設置糖化時間分別為36 h、48 h、60 h、72 h、84 h，發酵時間48 h不變，考察糖化時間對北五味子米酒品質的影響，結果見圖3。

圖3 糖化時間對米酒理化指標及感官評分的影響Fig.3 Effect of saccharification time on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖3可知，隨著糖化時間的延長，北五味子米酒中酒精度、還原糖及總酸含量都隨之升高，在糖化時間達48 h時，酒精度達6.78%vol，還原糖含量達23.35 g/100 g，總酸含量為0.18 g/100 g，此時米酒清澈，口感較好，感官評分最高達88.7分；在糖化時間48～84 h內，酒精生成量上升比較明顯，最高酒精度達9.74%vol，由于糖化過度使得米粒出現碎裂現象，酒味也變得更加濃烈，米酒品質下降，酒體渾濁，米酒感官評分下降。因此，最適宜糖化時間為48 h，此時米酒口感醇厚，風味純正，酒體協調，澄清度較好。

2.1.4 發酵時間對米酒理化指標及感官評分的影響

北五味子果漿添加量為16%，甜酒曲接種量為2.5%，糖化時間48h，設計發酵時間分別為32h、40h、48h、56h、64h，考察發酵時間對北五味子米酒品質的影響，結果見圖4。

圖4 發酵時間對米酒理化指標及感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖4可知，隨著發酵時間延長，米酒中還原糖呈現先升高后降低的趨勢，酒精度及總酸含量逐漸升高，發酵時間短，發酵液中根霉糖化不完全，米酒中還原糖及酒精度均較低，風味不顯著；延長發酵時間使淀粉被淀粉酶充分分解，發酵液總糖含量升高，在發酵時間達48 h時，還原糖含量達最高為19.90 g/100 g，酒精度為6.19%vol，總酸含量為0.34 g/100 g，此時酒體清澈、淡淡的酒香味，口感舒爽，感官評分較高達91.2分。發酵時間超過48 h，酵母發酵載體的底物濃度增大，使酵母對糖的利用度加速，總糖含量明顯下降，整個發酵體系代謝過程變緩，菌種衰減，米酒味道酸澀，口感下降，因此，最適宜發酵時間為48 h。

2.2 響應面試驗

通過響應面法對北五味子果漿添加量（A）、甜酒曲接種量（B）、糖化時間（C）、發酵時間（D）4個因素分析，設置3個水平對試驗條件進行優化，響應面試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 北五味子米酒釀造工藝條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process conditions optimization of Schisandra chinesisrice wine

通過DesignExpert8.0軟件對表3的數據進行分析，得到4個因素的多元回歸方程：Y=+84.28+8.27A+8.18B+10.21C+1.51D+0.88AB-2.83AC+2.65AD+0.98BC+6.25BD+4.47CD-5.17A2-6.42B2-8.44C2-6.86D2。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續表

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 0.84 0.11 4.67 2.39 5.19 8.00 13.79 9.12 0.375 1 0.741 1 0.048 5 0.144 2 0.039 0 0.013 4 0.002 3 0.009 2不顯著不顯著顯著不顯著顯著顯著極顯著極顯著殘差失擬項純誤差總離差28.09 3.80 156.25 80.10 173.60 267.63 461.60 305.33 486.60 372.95 95.65 4 465.05 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 10 4 28 28.09 3.80 156.25 80.10 173.60 267.63 461.60 305.33 33.47 37.30 23.91 1.560.354 8不顯著

根據表4方差分析結果可知，北五味子米酒感官評分的回歸方程與響應面試驗結果的關系模型顯著（P＜0.05），并且失擬項不顯著（P＞0.05），表明該試驗模型充分擬合試驗數據，即可以利用此感官評分的回歸方程確定北五味子米酒發酵的最佳工藝。

多元回歸方程一次項D和交互項AB、AC、AD、BC、CD對北五味子米酒感官評分沒有顯著性影響（P＞0.05），交互項BD、A2、B2對北五味子米酒感官評分表現出顯著的影響（P＜0.05），其中一次項A、B、C與二次項C2、D2對北五味子米酒感官評分影響為極顯著（P＜0.01），這表明四個試驗因素對五味子米酒響應值感官評分的影響不是單純的線性關系，而是表現為二次關系。

各因素對北五味子米酒感官品質的響應面結果見圖5。由圖5可知，甜酒曲接種量與發酵時間之間的交互作用對感官評分影響顯著（P＜0.05），與表4方差分析結果相吻合。隨著甜酒曲接種量的逐漸增加，造成發酵液酒精體積分數偏高，隨著發酵時間的延長，發酵液酒精中糖分不斷轉換成乙醇和香氣物質，導致感官評分分數偏高。北五味子果漿添加量、甜酒曲接種量、糖化時間三者對北五味子米酒感官評分的影響均較大，按主次順序排列為糖化時間＞北五味子果漿添加量＞甜酒曲接種量＞發酵時間；與表4方差分析結果相吻合。

圖5 北五味子果漿添加量、甜酒曲接種量、糖化時間、發酵時間交互作用對五味子米酒感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction betweenSchisandra chinesisfruit pulp addition,sweetJiuquinoculum,saccharification time and fermentation time on the sensory evaluation score ofSchisandra chinesisrice wine

2.3 優化條件的確定和模型驗證

通過軟件分析確定北五味子米酒最佳發酵工藝為北五味子果漿添加量為16.28%、甜酒曲接種量為2.15%、糖化時間為48.86 h、發酵時間47.64 h，北五味子米酒感官評分預測值為92.43分。為方便實際操作，根據3組驗證試驗對試驗數據進行適當調整，調整后北五味子果漿添加量16.3%、甜酒曲接種量為2.2%，糖化時間48.9 h，發酵時間47.6 h；采用此條件進行驗證試驗，得到北五味子米酒的感官評分為93.3分，實測值與預測值相對誤差為0.9%，表明該預測結果與真實試驗情況較符合，具有一定的參考價值。

2.4 響應面優化五味子米酒理化及微生物指標檢測結果

在北五味子米酒最佳發酵工藝條件下測定還原糖含量為11.94 g/100 g；酒精度為6.75%vol；總酸為0.86 g/100 g。北五味子米酒中微生物菌落總數34 CFU/g；大腸菌群1.87 MPN/100 g，未檢出其他致病菌。理化及微生物指標檢測結果符合NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》要求[26]。

3 結論

在單因素試驗的基礎上用響應面分析法對五味子米酒的發酵工藝條件進行了優化，影響北五味子米酒感官評分的工藝因素按主次順序排列為糖化時間＞北五味子果漿添加量＞甜酒曲接種量＞發酵時間。最終確定北五味子米酒最佳發酵工藝參數為北五味子果漿添加量16.3%、甜酒曲接種量為2.2%、糖化時間48.9 h、發酵時間47.6 h，采用此工藝釀造的北五味子米酒感官評分為93.3分。北五味子米酒湯色呈現棕褐色，清澈透明，有典型的米酒發酵香，酒味醇厚，入口甜美，營養豐富。米酒理化及微生物指標滿足相關標準要求。