燕麥蘋果復合果醋發酵工藝優化及其抗氧化活性

王榮榮，張小雨，張嬌嬌，賈玉香，王家東，杜 鵬，鄭 宇，宋 佳*

（1.信陽農林學院 食品學院，河南 信陽 464000；

2.天津科技大學生物工程學院天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457；

3.信陽農林學院 生物與制藥工程學院，河南 信陽 464000）

燕麥（Avena sativaL.）屬禾本科植物，是集食用、飼用、經濟、生態與社會價值于一體的農作物[1-2]。燕麥具有較高的營養價值，富含淀粉、蛋白質、脂肪酸、維生素和礦物質等營養成分，同時富含豐富的膳食纖維，有促腸胃蠕動、降血脂、降血糖、抗氧化、減肥、增強免疫力等功效[3-8]。燕麥的抗氧化成分主要是多酚黃酮類物質，同時燕麥中的維生素E（vitamin E，VE）、甾醇、羥基脂肪酸也有一定的抗氧化作用[9-11]。β-葡聚糖作為目前燕麥功能成分研究熱點之一，已被證實燕麥降血脂和降餐后血糖功能與其富含的β-葡聚糖密切相關，燕麥中β-葡聚糖具有降低血清膽固醇、調節血糖水平、改善腸道菌群、增強免疫力、保護肝損傷等功能[12-16]。

蘋果（Malus pumilaMill.）中含有糖類、果膠、維生素、礦物質及有機酸等多種成分[17]。蘋果醋是蘋果汁經酵母菌、醋酸菌等微生物發酵而成。近年來研究發現，蘋果醋具有促進新陳代謝、調節酸堿平衡、消除疲勞等功能[18]。蘋果醋能清洗消化系統，促進關節、血管及其他內臟等器官長期積累的毒素代謝，還具有降低血脂和促進排毒的作用[19]。

本研究將燕麥粉碎后，混合蘋果汁進行酒精發酵，后接種醋酸菌進行醋酸發酵制備燕麥蘋果復合果醋，通過單因素和響應面試驗優化醋酸發酵工藝，并利用2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonat，ABTS）法和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法對燕麥蘋果醋黃酮類物質抗氧化活性進行測定分析，并采用氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀對產品中的黃酮類化合物進行檢測分析，為產業化開發燕麥蘋果復合果醋產品提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥、鮮蘋果、蔗糖：市售；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）CP-A11：天津科技大學微生物制藥研究室；無水乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：天津天力化學試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：山東西王糖業有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；硅烷化試劑（N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）+1%三甲基氯硅烷trimethylchlorosilane，TMCS）（色譜純）：美國Sigma公司。

GY培養基：1%酵母膏，3%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%碳酸鈣，3.5%vol乙醇。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A型氣質聯用儀：美國安捷倫公司；TG16-WS型高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；FD-1C-50真空冷凍干燥機：北京博醫康儀器有限公司；200Y粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；HLG-A恒溫振蕩培養箱：太倉市實驗設備廠；HH-2水浴鍋：邦西儀器科技（上海）有限公司；C18固相萃取柱：美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 燕麥蘋果復合果醋加工工藝流程及操作要點

操作要點：取新鮮經清洗、去核去皮的蘋果破碎后用螺旋榨汁機榨汁，過濾得到的蘋果汁與粉碎并過40目篩燕麥按一定比例調配，并添加適量蔗糖至總糖含量為200～220 g/L，然后按照15%接種量接入已經用33～35℃溫水活化30 min的酵母液，25℃靜置發酵10 d，即得燕麥蘋果復合果酒，此時酒精度為8%vol～12%vol，總糖含量為（11.9±1.5）g/L。調整初始酒度為4%vol～12%vol，將已用GY培養基活化12 h后的醋酸菌按2%～12%接種量接入燕麥蘋果復合果酒，26～36℃、120～200 r/min條件下恒溫發酵8 d，可得燕麥蘋果復合果醋，最后經板框壓濾機壓濾澄，進行巴氏消毒（68～70℃、30 min），即得燕麥蘋果復合果醋。

1.3.2 醋酸發酵工藝優化單因素試驗

以總酸含量為評價指標，分別考察影響醋酸發酵的主要因素：醋酸菌接種量、發酵溫度、搖床轉速及發酵初始酒精度等單因素對醋酸發酵的影響。裝液量為50mL/250mL，每組設置3個平行試驗，具體考察條件參數如下所示：考察不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同發酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）、不同搖床轉速為（120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）及不同初始酒精度（4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol）對總酸含量的影響。

1.3.3 醋酸發酵工藝優化響應面試驗

采用響應面試驗設計，以接種量（A）、初始酒精度（B）、搖床轉速（C）、發酵溫度（D）為影響因素，以總酸含量（Y）為響應值，設計4因素3水平響應面試驗，各因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 抗氧化活性分析

（1）黃酮類物質的提取

參照文獻[20]的方法，取燕麥蘋果復合果醋100 mL于5 000 r/min轉速條件下離心，上清液調pH值至2.0（此時黃酮類化合物的穩定性最好，不易被氧化），通過C18固相萃取柱，控制流速1 mL/min。將C18固相萃取柱置于冷凍干燥機中凍干除去水分，同時減少黃酮類物質被氧化，用于后續氣質聯用分析，用等體積的洗脫液（甲基叔丁基醚∶甲醇=3∶2，V/V）洗脫柱填料中的黃酮類物質，將收集到的洗脫液氮氣吹至干，將得到的黃酮類物質干粉分成兩部分，一部分用于后續的抗氧化試驗研究，另一部分加入1 mL硅烷化試劑于50℃反應60min，將反應液過0.22μm濾膜備用。

（2）ABTS自由基清除率的測定[21]

維生素C（VitaminC，VC）標準曲線的繪制：將維生素C標準液稀釋成1 mg/100 mL、5 mg/100 mL、10 mg/100 mL、15mg/100mL、20mg/100mL。在96孔板中加入200μLABTS工作液后，加入10 μL各質量濃度VC稀釋液，空白組中為10μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），混勻，室溫避光孵育5min，測定波長734nm處的吸光度值，以VC質量濃度（x）為橫坐標，ABTS自由基清除率（y）為縱坐標，繪制VC標準曲線，得標準曲線回歸方程為y=4.9089x-3.47534，相關系數R2為0.9997。ABTS自由基清除率計算公式如下：式中：A空白表示空白組的吸光度值，A樣品表示樣品組的吸光度值。

抗氧化活性測定：將復合果醋黃酮類物質溶解后，在96孔板中加入200 μL ABTS工作液后，加入10 μL的上述制備的粗黃酮凍干樣品，混勻，室溫避光孵育5 min，測定波長734 nm處的吸光度值，按照VC標準曲線計算燕麥蘋果醋黃酮類物質的抗氧化活性，結果以維生素C等值當量（vitamin C equivalent，VCE）表示（mg VCE/L）。

（3）DPPH自由基清除率的測定[22]

取1 mL粗黃酮溶液（0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.100 mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL）于具塞試管中，與0.1mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液1mL混合反應20min后，355 r/min離心10 min，取上清液在波長517 nm處測定吸光度值，記為Ai，同時用乙醇作空白對照，吸光度值記為Ac，以及1mL樣品水溶液和1mL無水乙醇混勻按上述方法測定吸光度值，記為Aj。DPPH自由基清除率計算公式如下：

1.3.5 燕麥蘋果復合果醋中黃酮類物質檢測[23]

采用氣相色譜質譜聯用（GC-MS）法測定復合果醋中黃酮類物質。GC條件：HP-5色譜柱（30 mm×0.25 mm×1 μm），進樣口溫度300℃；載氣為氦氣（He），流速1mL/min；進樣量1.5μL，分流比10∶1；升溫程序：初始溫度為60℃，以5℃/min升至300℃。MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；數據采集頻率3 Hz；掃描范圍45～999 m/z。

1.3.6 數據分析

每個樣品至少3次重復數據，采用SPSS 20.0軟件進行方差分析和Tukey's相關性分析，采用Origin 8.5軟件作圖，實驗數據以平均值±標準差（X±SD）表示，顯著性差異以P＜0.05為標準。

2 結果與分析

2.1 醋酸發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 接種量對總酸含量的影響

發酵過程接種量的大小會影響發酵時間的長短，進而影響總酸的含量[24]。本試驗在發酵溫度30℃、搖床轉速150 r/min、初始酒精度為8%vol條件下，醋酸菌接種量設置為2%、4%、6%、8%、10%、12%（V/V），發酵8d后，測定各組總酸含量，結果見圖1。由圖1可知，總酸含量隨接種量在2%～8%（V/V）范圍內增加而增高，并在接種量＞8%（V/V）之后趨于穩定。因此，最適醋酸菌接種量為8%（V/V）。

圖1 接種量對總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculum on total acid content

2.1.2 發酵溫度對總酸含量的影響

微生物發酵過程中各種酶的作用至關重要，溫度是影響酶活力的重要因素之一。正常情況下，溫度過高或偏低都會直接影響酶活力[25]。醋酸菌在不同的生長階段對溫度的敏感性也不同，在接種量為8%、搖床轉速150 r/min、初始酒精度為8%vol條件下，發酵溫度設置為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，發酵8 d后，測定各組總酸含量，結果見圖2。由圖2可知，總酸含量隨溫度在26～32℃范圍內增加而增高，并在溫度為32℃時總酸含量最高，溫度高于32℃之后下降。因此，最適發酵溫度為32℃。

圖2 發酵溫度對總酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid content

2.1.3 搖床轉速對總酸含量的影響

搖床轉速與發酵液中的溶解氧呈正相關關系[26]。對于醋酸菌等好氧微生物而言，發酵液中的溶解氧會影響其自身的生長代謝。在接種量為8%、發酵溫度為32℃、初始酒精度為8%vol條件下，搖床轉速設置為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，發酵8 d后，測定各組總酸含量，結果見圖3。由圖3可知，總酸含量隨轉速在120～160 r/min范圍內增加而增高，并在轉速為160 r/min時總酸含量最高，轉速＞160 r/min之后總酸含量趨于穩定。因此，最適轉速為160 r/min。

圖3 搖床轉速對總酸含量的影響Fig.3 Effect of rotational speed on total acid content

2.1.4 初始酒精度對總酸含量的影響

醋酸菌對酒精具有一定的耐受性，低酒精濃度下有利于酸的產生，但較高的酒精濃度會影響醋酸菌的活性[27]。在接種量8%、發酵溫度32℃、搖床轉速160 r/min條件下，初始酒精度設置為4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol，發酵8d后，測定各組總酸含量，結果見圖4。由圖4可知，總酸含量隨初始酒精度在4%vol～8%vol范圍內增加而增高，并在初始酒精度為8%vol時總酸含量最高，初始酒精度＞8%vol之后總酸含量下降。因此，最適初始酒精度為8%vol。

圖4 初始酒精度對總酸含量的影響Fig.4 Effect of initial alcohol content on total acid content

2.2 醋酸發酵工藝優化響應面試驗

以單因素試驗得到對總酸含量影響較大的4個因素進行4因素3水平響應面試驗，試驗方案及結果見表2，方差分析見表3。

采用Design-Expert.V8.0.6.1對表2結果進行響應面回歸分析，經分析得到一個多元二次回歸方程：

Y=6.64-0.058A+0.022B+0.046C-0.33D+0.032AB-0.027AC+0.041AD+0.010BC-0.014BD+6.27E-003CD-0.043A2+9.84E-003B2+0.052C2+0.19D2

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續表

注：“**”表示對結果影響極顯著（P＜0.01）；“*”表示對結果影響顯著（P＜0.05）。

由表3可知，該回歸方程模型P值＜0.000 1，表明模型極顯著；模型的失擬項的F值和P值分別為2.68和0.177 6，證明失擬項不顯著，表明回歸模型是合適的，可以用來分析和預測醋酸發酵工藝條件。模型決定系數R2為0.937 0，說明93.70%的期望值變化可以用這一多項式解釋。一次項A對響應值的影響顯著（P＜0.05）、一次項D和二次項D2對響應值的影響極顯著（P＜0.01）。由Design-Expert8.06軟件得出最佳醋酸發酵工藝條件為醋酸菌接種量7.3%、初始酒精度8.9%vol、轉速169r/min、發酵溫度31℃。在此條件下總酸含量理論值為7.34 g/100 mL。為了便于實際操作，將上述最佳醋酸發酵工藝條件為接種量7%、初始酒精度9%vol、轉速170r/min、發酵溫度31℃。以此條件進行3次平行驗證試驗，最終得到的總酸含量為（7.35±0.04）g/100mL，與理論值基本一致，說明響應面法得出的醋酸發酵工藝條件是可行的。

2.3 燕麥蘋果醋抗氧化活性分析[28-30]

2.3.1 ABTS法分析燕麥蘋果復合果醋抗氧化活性

利用ABTS法對其抗氧化活性進行測定可得出不同質量濃度粗黃酮與ABTS清除率的關系，結果如圖5所示，隨著燕麥蘋果復合果醋中黃酮物質含量的增加，其ABTS自由基清除率逐步升高，同時依據1.3方法計算出燕麥蘋果醋黃酮類物質抗氧化活性值為（100.27±3.53）mgVCE/L，能有效清除ABTS自由基，表現出較高的抗氧化活性。

圖5 燕麥蘋果復合果醋粗黃酮清除ABTS曲線Fig.5 ABTS scavenging curve of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar

2.3.2 DPPH法分析燕麥蘋果復合果醋抗氧化活性

由圖6可知，DPPH自由基清除能力與燕麥蘋果復合果醋提取黃酮類物質含量呈量效關系，即隨著黃酮類物質含量的增加，DPPH自由基清除能力逐漸增加，表明燕麥蘋果復合果醋中黃酮類物質具有較好的抗氧化活性，清除率可達（60.21±1.56）%，其DPPH自由基清除率與鄭淑彥[31]利用氯仿/乙酸乙酯萃取枳椇醋得到物質的DPPH自由基清除活性一致。

圖6 燕麥蘋果復合果醋粗黃酮含量清除DPPH曲線Fig.6 DPPH scavenging curve of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar

2.4 燕麥蘋果醋中黃酮化合物GC-MS檢測結果

通過氣相色譜質譜聯用儀對燕麥蘋果醋中的黃酮類化合物進行檢測，總離子流色譜圖見圖7。

圖7 燕麥蘋果復合果醋黃酮化合物GC-MS分析總離子流圖Fig.7 Total ions chromatogram of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar analyzed by GC-MS

根據燕麥蘋果醋樣品GC-MS總離子流圖中質譜特征、保留參數，比對查詢美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）11譜庫，得到樣品中黃酮類化合物種類、結構式及特征峰保留時間，結果見表4。由表4可知，燕麥蘋果復合果醋中共檢測到3種黃酮類化合物，分別為木犀草素、山柰酚和槲皮素。實驗研究證明[32-33]，這3種黃酮類化合物具有較高的抗氧化活性。

表4 燕麥蘋果復合果醋中黃酮類化合物GC-MS分析結果Table 4 Results of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar analyzed by GC-MS

3 結論

通過響應面試驗設計對燕麥蘋果醋醋酸發酵階段影響因素進行分析并對工藝條件進行優化，在接種量7%（V/V）、發酵溫度31℃、轉速170r/min、初始酒精度9%vol條件下，總酸含量為（7.35±0.04）g/100mL，比未優化前提高19.67%。通過ABTS法對燕麥蘋果醋黃酮類物質抗氧化活性進行測定，其抗氧化活性值為（100.27±3.53）mgVCE/L，對ABTS自由基有較好的清除能力，同時測定其DPPH自由基清除率可達（60.21±1.56）%，表明燕麥蘋果醋具有較高的抗氧化活性。并利用GC-MS法從燕麥蘋果醋產品中共檢出3種黃酮類化合物，分別為木犀草素、山柰酚及槲皮素。研究結果對燕麥蘋果醋產品開發提供了技術支持。