野生藍(lán)莓保健果酒的工藝優(yōu)化

胡佳星，袁文艷，滿都拉，孫子羽，張璐瑤，陳忠軍*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，人們開始追求綠色健康的高品質(zhì)生活，而富含功能因子的各種果酒，深受消費(fèi)者的喜愛。藍(lán)莓（Vacciniumspp.）屬于杜鵑花科的一類灌木[1]，通常在酸性土壤中生長，在我國藍(lán)莓主要分布在大興安嶺地區(qū)附近。藍(lán)莓因其含有多種營養(yǎng)因子，如錳元素、維生素B6（vitamin B6，VB6）、VC、VK、花色苷、黃酮和膳食纖維等，被人們譽(yù)為“水果皇后”[2-3]，其中最受人關(guān)注的便是藍(lán)莓中的花青素?；ㄇ嗨刈鳛橐环N黃酮類化合物，具有清除自由基、抗氧化、改善視力、抗增生、減肥和降血脂等功效[4-8]。由于藍(lán)莓果易于氧化，不易保存，因此以野生藍(lán)莓為原料發(fā)酵的藍(lán)莓果酒，不僅可以延長藍(lán)莓的保質(zhì)期，而且能夠有效的保留藍(lán)莓的風(fēng)味及其營養(yǎng)物質(zhì)。但由于藍(lán)莓果汁初始pH較低，普通酵母菌因其耐酸性較差在發(fā)酵過程中，導(dǎo)致藍(lán)莓酒起發(fā)速度較慢或發(fā)酵提前終止。陳小玲[9]以篩選得到的野生酵母菌株為發(fā)酵劑，通過采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓果酒發(fā)酵工藝，在發(fā)酵初始糖度為25°Bx，酵母接種量為5%，酶添加量0.4%的條件下24℃發(fā)酵8 d后，得到花青素含量為322.58 mg/L、酒精度為12.5%vol的藍(lán)莓果酒。謝洋洋[10]以安琪釀酒酵母為發(fā)酵菌株，經(jīng)單因素、正交試驗(yàn)確定了發(fā)酵初始pH值為3.3，初始糖度10°Bx，酵母菌接種量0.1%，于25℃發(fā)酵的最佳藍(lán)莓果酒發(fā)酵工藝。李婧等[11]利用活性干酵母發(fā)酵藍(lán)莓汁，經(jīng)過皂土澄清，得到了果香濃郁的藍(lán)莓果酒，為藍(lán)莓果酒的發(fā)酵提供了參考。本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室篩選的可耐pH值為1.8的耐酸酵母菌株YM1-1和產(chǎn)酯酵母菌株T1作為復(fù)合發(fā)酵菌株，通過設(shè)計(jì)單因素及正交試驗(yàn)確定藍(lán)莓酒最優(yōu)的發(fā)酵工藝[12]，藍(lán)莓酒發(fā)酵工藝的探究為工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考并奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍(lán)莓：內(nèi)蒙古根河野生資源開發(fā)公司；耐酸酵母菌株YM1-1、產(chǎn)酯酵母菌株T1：本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏；白砂糖：市售；鹽酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸：天津化學(xué)試劑三廠；無水乙醇：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；大豆蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂（均為生化試劑）：南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；果膠酶（酶活為20000U）：煙臺伯爵士酵母有限公司。所用試劑均為分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104N電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；A-103多功能榨汁攪拌機(jī)：浙江順敬工貿(mào)有限公司；BKQB100II高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；PHS-3CpH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PAL-1糖度儀：青島聚創(chuàng)美家環(huán)保技術(shù)有限公司；LRH-500F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺：濟(jì)南來保醫(yī)療器械有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：常州市金壇華偉儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓酒工藝流程及操作要點(diǎn)

打漿：將藍(lán)莓用榨汁機(jī)榨得藍(lán)莓汁

果膠酶酶解：藍(lán)莓汁中添加30 mg/L果膠酶，并于25℃酶解20 min；

浸漬：將酶解得到藍(lán)莓汁于35℃水浴浸漬40 min；

離心分離：將上述處理的藍(lán)莓汁在5 000 r/min的條件下離心10 min，得到澄清藍(lán)莓汁；

成分調(diào)整：野生藍(lán)莓打漿離心后加水（體積比為1∶1）得到藍(lán)莓汁，添加白砂糖調(diào)節(jié)初始糖度為12.5°Bx，SO2添加量為60 mg/L；

菌株活化：將斜面保藏的YM1-1菌株和T1菌株，分別在無菌環(huán)境中用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于YEPD培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，將其以2%的接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，并在28℃恒溫培養(yǎng)48 h，根據(jù)以上操作再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)的第3代菌液用于以下試驗(yàn)；

菌懸液的制備：將10 mL三代菌液在4 000 r/min的條件下離心3 min后倒掉上清液，并用無菌生理鹽水將離心的菌泥進(jìn)行洗滌，用漩渦儀混合均勻后，依據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)的方法，將活菌濃度調(diào)整為1×108CFU/mL[13]；

后發(fā)酵：主發(fā)酵得到的藍(lán)莓酒于12℃后酵20 d；

穩(wěn)定性處理：通過不斷倒桶和膜過濾實(shí)現(xiàn)。

1.3.2 藍(lán)莓酒工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）SO2添加量對藍(lán)莓酒的影響：在接種量為5%，產(chǎn)酯酵母：耐酸酵母為1∶1（V/V），初始pH值為3.0，果膠酶添加量為20 mg/L的條件下，調(diào)整SO2添加量分別為30 mg/L、60 mg/L、90 mg/L、120 mg/L、150 mg/L，24℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標(biāo)，分析SO2添加量對藍(lán)莓酒的影響。

（2）果膠酶添加量對藍(lán)莓酒的影響：調(diào)整果膠酶添加量分別為20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L，24℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標(biāo)，分析果膠酶添加量對藍(lán)莓酒的影響。

（3）初始pH值對藍(lán)莓酒的影響：用檸檬酸和檸檬酸鈉將發(fā)酵醪液初始pH值分別調(diào)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標(biāo)，分析發(fā)酵初始pH值對藍(lán)莓酒的影響。

（4）接種量對藍(lán)莓酒的影響：按照藍(lán)莓發(fā)酵醪液體積的5%、6%、7%、8%、9%的接種量分別進(jìn)行接種，于24℃發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標(biāo)，分析酵母菌接種量對藍(lán)莓酒的影響。

（5）接種比例對藍(lán)莓酒的影響：產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母接種比例分別為1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1（V/V），于24 ℃發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標(biāo)，分析接種比例對藍(lán)莓酒的影響。

（6）發(fā)酵溫度對藍(lán)莓酒的影響：分別于發(fā)酵溫度為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的條件下發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標(biāo)，分析發(fā)酵溫度對藍(lán)莓酒的影響。

1.3.3 藍(lán)莓酒工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，挑選對藍(lán)莓酒影響較大的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，進(jìn)行綜合研究分析，并確定最佳工藝條件組合。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 藍(lán)莓酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of blueberry wine

1.3.4 測定方法

（1）感官評定方法

邀請13位經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員，從酒液外觀、香氣、果渣沉淀狀況、口感四個(gè)方面對藍(lán)莓酒進(jìn)行感官評定。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。滿為100分，感官評價(jià)最終得分為13人評分的平均值[14]。（2）花青素含量：按照參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測定。（3）酒精度：用蒸餾法測定；殘?zhí)牵菏褂帽銛y式手持糖度計(jì)測定；糖醇轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式[18]式中：S為糖醇轉(zhuǎn)化率，%；C為酒精度，%vol；G為糖度，°Bx。

表2 藍(lán)莓酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of blueberry wine

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 SO2添加量對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響

圖1 SO2添加量對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of SO2addition on blueberry wine quality

由圖1可知，隨著SO2添加量的增加，藍(lán)莓果酒中花青素含量及其感官評分均呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)SO2添加量為60 mg/L時(shí)，感官評分和花青素含量均達(dá)到最大值，分別為82分和205.9 mg/L；因?yàn)镾O2本身具有還原性，適量的SO2對花青素有保護(hù)作用，同時(shí)可以有效的抑制雜菌生長[17]，但過量的SO2一方面會(huì)產(chǎn)生不良的氣味影響藍(lán)莓酒的品質(zhì)；另一方面SO2會(huì)與酒中花青素發(fā)生加成反應(yīng)，使花青素含量降低，同時(shí)酒體顏色變淺，影響外觀。因此，選擇最佳SO2添加量為60 mg/L。

2.1.2 果膠酶添加量對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響

圖2 果膠酶添加量對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of pectinase addition on blueberry wine quality

由圖2可知，當(dāng)果膠酶添加量為20～60 mg/L時(shí)，隨著果膠酶添加量的增加，藍(lán)莓酒中花青素含量及感官評分呈先升高后降低趨勢。果膠酶添加量為30 mg/L時(shí)，藍(lán)莓酒中花青素的含量及感官評分均為最高，分別為230.7 mg/L和85.5分；當(dāng)果膠酶添加量＜30 mg/L之前，隨著添加量的增加，花青素含量及感官評分顯著性上升（P＜0.05），原因是果膠酶濃度較低沒有使藍(lán)莓中果膠物質(zhì)等充分水解，進(jìn)而有效成分沒有充分溶出所以花青素含量較低，同時(shí)藍(lán)莓酒的色澤較淺影響感官；當(dāng)果膠酶添加量＞30 mg/L之后，由于果膠酶濃度太高，果膠酶酶解破壁反應(yīng)已經(jīng)相對徹底，所以過多的果膠酶可能會(huì)水解產(chǎn)生其他物質(zhì)，從而造成花青素含量及感官評分下降[18]。因此，選擇最佳果膠酶添加量為30 mg/L。

2.1.3 初始pH值對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響

圖3 初始pH值對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of initial pH on blueberry wine quality

由圖3可知，隨著發(fā)酵初始pH的升高，藍(lán)莓酒中花青素含量及感官評分均呈現(xiàn)顯著性先上升后下降（P＜0.05）。當(dāng)pH值為3.5時(shí)，藍(lán)莓酒中花青素含量以及感官評分均達(dá)到最大值，分別為243.8 mg/L和85.6分。這可能是由于發(fā)酵初始pH值對酵母菌的生長繁殖影響較大，不同的發(fā)酵初始pH值不僅會(huì)影響酵母代謝而且影響藍(lán)莓酒的口感。同時(shí)花青素在酸性條件下穩(wěn)定性較好，在中性或者堿性條件下穩(wěn)定性會(huì)變差[19]。因此，選擇最佳發(fā)酵初始pH值為3.5。

圖4 接種量對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of inoculum on blueberry wine quality

2.1.4 接種量對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響由圖4可知，在酵母接種量為5%～9%時(shí)，花青素含量及感官評分隨著酵母接種量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)接種量為6%時(shí)花青素含量和感官評分均較高，分別為253.7 mg/L和86.2分。原因可能是隨著酵母菌接種量的增加酒體中酵母菌的代謝產(chǎn)物也在增加。合適的接種量一方面會(huì)產(chǎn)生適量的芳香類代謝產(chǎn)物提高保健酒的品質(zhì)，另一方面使藍(lán)莓酒發(fā)酵速度加快有利于活性物質(zhì)保留。但過量的酵母菌接種量又會(huì)產(chǎn)生不良的酵母味，影響藍(lán)莓酒風(fēng)味，同時(shí)花青素會(huì)與代謝產(chǎn)物結(jié)合[20]，使花青素大量損失。因此，選擇最佳酵母接種量為6%。

2.1.5 酵母接種比例對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響

圖5 酵母接種比例對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of inoculum ratio on quality of blueberry wine

由圖5可知，隨著藍(lán)莓酒中兩種酵母菌的接種比例的變化，藍(lán)莓果酒的花青素含量及感官評分均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。在產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母為1∶2（V/V）時(shí)，酒中花青素的含量和感官評分均達(dá)到最大，分別為279.4 mg/L和87.6分，不同的接種比例對藍(lán)莓酒中花青素的含量以及感官評分均有影響，可能是因?yàn)榻臃N比例不同發(fā)酵液中最終兩株菌數(shù)量不同，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等不同進(jìn)而使得最終藍(lán)莓酒的風(fēng)味口感以及花青素含量發(fā)生改變。因此，選擇最佳菌株接種比例為產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母=1∶2（V/V）。

2.1.6 發(fā)酵溫度對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響

圖6 發(fā)酵溫度對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on blueberry wine quality

由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，花青素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，感官評分呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為26℃時(shí)，感官評分和花青素含量均達(dá)到最大，分別為86.9分和281.7 mg/L。當(dāng)發(fā)酵溫度低于26℃之前，花青素含量和感官評分均較低，可能原因是當(dāng)溫度過低時(shí)，影響酵母生長代謝速率進(jìn)而影響藍(lán)莓酒酒精度和口感，同時(shí)低溫會(huì)使花青素溶解度降低，藍(lán)莓酒中花青素含量降低；當(dāng)發(fā)酵溫度高于26℃之后，花青素含量及感官評分均有所下降，由于發(fā)酵溫度過高時(shí)，酵母生長代謝過于旺盛[21]，造成糖類未能完全被徹底轉(zhuǎn)化為酒精，影響口感。同時(shí)酵母生長代謝旺盛產(chǎn)生代謝產(chǎn)物過多，花青素會(huì)與代謝產(chǎn)物結(jié)合使最終發(fā)酵藍(lán)莓酒中花青素含量降低，例如酵母菌在發(fā)酵階段產(chǎn)生的丙酮酸、乙醛以及一些酶類會(huì)使花青素降解。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為26℃。

2.2 藍(lán)莓酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表3可知，當(dāng)以花青素含量為評價(jià)指標(biāo)分析時(shí)，各因素對藍(lán)莓酒花青素含量的影響次序?yàn)槌跏紁H值＞果膠酶添加量＞接種量＞SO2添加量，表明初始pH值對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響最大。最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)組合為A2B1C1D1，即SO2添加量為60 mg/L，產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母為1∶2（V/V），接種量為5.5%，果膠酶添加量為25 mg/L，發(fā)酵初始pH值為3.2。在此條件下發(fā)酵藍(lán)莓酒的花青素含量為350.4 mg/L，感官評分為87分。

當(dāng)以感官評定為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，各因素對藍(lán)莓酒感官評分的影響次序?yàn)镾O2添加量＞接種量=果膠酶添加量=初始pH值，表明SO2添加量對藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響最大。結(jié)果顯示以感官評分為評定指標(biāo)的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)組合為A2B2C2D3，即在SO2添加量為60 mg/L，產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母為1∶2（V/V），接種量為6.0%，果膠酶添加量為30 mg/L，發(fā)酵初始pH值為3.8。在此條件下發(fā)酵藍(lán)莓酒的花青素含量為368.5mg/L，感官評分為87分。

表3 藍(lán)莓酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of blueberry wine

基于驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果對比，在組合A2B2C2D3條件下發(fā)酵的藍(lán)莓酒感官評分為87分，花青素含量為368.5 mg/L，所以最終選擇組合A2B2C2D3為最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)組合。

2.3 藍(lán)莓酒質(zhì)量評價(jià)

在此條件下發(fā)酵得到果香濃郁、口感醇厚的低酒精度藍(lán)莓酒，酒精度為4.2%vol，殘?zhí)菫?.0°Bx，糖醇轉(zhuǎn)化率為33.6%，花青素含量為368.5 mg/L。

3 結(jié)論

本研究以耐酸酵母YM1-1和產(chǎn)酯酵母T1為試驗(yàn)菌株，藍(lán)莓汁與水體積比1∶1，調(diào)節(jié)初始糖度為12.5°Bx為發(fā)酵醪液，經(jīng)單因素及正交試驗(yàn)確定藍(lán)莓酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝為SO2添加量60 mg/L，以產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母接種比例1∶2（V/V），接種量6.0%，果膠酶添加量30 mg/L，發(fā)酵初始pH值3.8的條件下，于26℃發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，在此優(yōu)化發(fā)酵條件下釀造得到的藍(lán)莓保健酒酒精度為4.2%vol，殘?zhí)菫?.0°Bx，感官評分為87分，糖醇轉(zhuǎn)化率為33.6%，花青素含量為368.5 mg/L。